Name: a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00
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Agradecemos sinceramente Shigeo Kita, por suas valiosas sugestões e discussão. Agradecemos também a John e Sumire Eckstein para sua leitura crítica do manuscrito.

Nota: As amostras utilizadas neste estudo foram microorganismos, rapidamente congelados com propano em nitrogênio líquido, congelam substituídos em acetona contendo 2% de tetróxido de ósmio e incorporado em epóxi resina1,2,3, 4,5,6,7,8,<su...

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	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+ultrastructure+of+yeast+cells+by+electron+microscopy.">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy.">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Exophiala+yeast+cells+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li><li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density.">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li><li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis,+which+survives+with+only+700+ribosomes+at+density+per+0.1+fl+cytoplasm.">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea.">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryote+or+eukaryote?+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea.">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning+of+the+Myojin+parakaryote+discovered+in+the+deep+sea.">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-sea+microorganisms+and+the+origin+of+the+eukaryotic+cell.">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+microorganisms:+from+influenza+virus+to+deep-sea+microorganisms.">An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms.</a> JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+specimen+preparation+for+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+of+yeast+cells.">Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells.</a> J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis+cell+by+freeze-substitution+and+serial+sectioning+electron+microscopy.">Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).</li><li>Kozubowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+kinetochore+assembly+in+the+human+pathogenic+basidiomycetous+yeast,+Cryptococcus+neoformans.">Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans.</a> mBio. 4, e00614-e00613 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+support.">Specimen support.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).</li><li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+films.">Support films.</a> Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).</li><li>Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning.">Ultrathin sectioning.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+hydrophilicity/hydrophobicity+of+the+plasma-polymerized+naphthalene+film+(Super+support+film)+and+other+support+films+and+grids+in+electron+microscopy.">Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy.</a> Microscopy. 65, 444-450 (2016).</li><li>Kita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+using+new+small+tools.">Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools.</a> Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+use+of+uranyl+acetate+solution+in+section+staining+in+transmission+electron+microscopy.">Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy.</a> Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).</li><li>Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+collection+of+ultrathin+serial+sections+for+large+volume+TEM+reconstructions.">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).</li><li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

O método apresentado aqui não requer nenhum equipamento caro. Requer apenas um rack de alumínio (Figura 3), grades de três-fenda (Figura 6C), seção-exploração loops (Figura 10a), loop de água de superfície-sensibilização (Figura 11a) e um tubo de coloração (Figura 13). Há muitas características do presente método. A grande parte da amostra é usada para aju...

Técnica de corte apropriada serial ultrafino é indispensável para o estudo de células e componentes celulares tridimensionalmente em nível microscópico elétrons. Temos estudado a dinâmica do corpo de polo do eixo no ciclo celular de células de levedura e revelou alterações morfológicas da sua ultra-estrutura durante o ciclo celular e o tempo de duplicação1,2,3, 4,5. Em 2006, cunhou uma nova palavra 'structome' combinando 'estrutura' e '-ome' e definiu-o como o 'informações quantitativas e tridimensional estrutural de uma célula inteira em nível microscópico elétrons' 6,7.
Pela análise de structome, que requer técnica de seccionamento serial ultrafino, verificou-se que uma célula de levedura Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis tinha cerca de 200.000 ribossomos7,8, um Escherichia coli célula tinha 26.000 ribossomas9, uma célula de Mycobacterium tuberculosis tinha 1.700 ribossomas10 e bactérias de espiral Myojin tinham apenas 300 ribossomas11. Esta informação é útil na estimativa não somente a taxa de crescimento em cada organismo, mas também na identificação das espécies9.
Análises posteriores, structome levado à descoberta de um novo organismo; Parakaryon myojinensis foi encontrado no fundo do mar na costa do Japão, cuja estrutura de célula era um intermediário entre aqueles de procariotas e eucariotas12,13,14,15. Presentemente, técnica de corte ultrafino serial é considerada tão difícil que levaria muito tempo para dominar. Neste estudo, nós desenvolvemos um método confiável, no qual qualquer um pode executar seccionamento ultrafinos serial sem dificuldade.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Formvar making apparatus</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>652</td>
			<td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>-</td>
			<td>76 x 26 x 1.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum rack with 4-mm holes</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>658</td>
			<td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic trimming blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesa cut</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit nickel grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2458</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit copper grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2459</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Section-holding loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>526</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-surface-raising loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>527</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining tube</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-specimen holder</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>EM-11170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

Observação de células e componentes da célula em três dimensões em alta ampliação em microscopia eletrônica de transmissão exige a preparação de seções ultra-finas seriais do espécime. Ainda preparar seções ultra-finas seriais é considerado muito difícil, é bastante fácil... se for usado o método adequado. Neste trabalho, mostramos um procedimento passo a passo para a obtenção de segurança seriais seções ultra-finas de microorganismos. Os pontos-chave deste método são: 1) para usar a grande parte da amostra e ajustar a borda de superfície e faca de amostra, de modo que eles são paralelos uns aos outros; 2) para cortar seções seriais em grupos e evitar a dificuldade em separar seções usando um par de fios de cabelo ao recuperar um grupo de seções seriais para as grades de fenda; 3) usar um 'loop' seção-exploração e evitar mistura-se a ordem dos grupos seção; 4) para usar um loop de' água de superfície-sensibilização' e certifique-se que as seções são posicionadas no ápice da água e que tocam a grade em primeiro lugar, a fim de colocá-los na posição desejada nas grades; 5) para usar o suporte de filme em um rack de alumínio e torná-lo mais fácil para recuperar as seções sobre as grades e evitar enrugar-se do filme suporte; e 6) para usar um tubo de coloração e evitar quebrar acidentalmente os filmes de apoio com uma pinça. Este novo método permite a obtenção de seções ultra-finas seriais sem dificuldade. O método torna possível analisar estruturas celulares dos microorganismos em alta resolução em 3D, que não pode ser alcançado usando o método de ultramicrotome de fita de coleta automática e bloco-rosto serial ou microscópio eletrônico de varredura de feixe de íon focalizado.

Neste protocolo, fenda três grades foram usados para pegar seriais seções. As grades são feitas de níquel ou cobre. As seções seriais são colocadas na ranhura do meio. As fendas em ambos os lados são necessárias para ver as seções quando pegá-los com a grade. Para manter as grades paralelas com as seções seriais quando pegá-los com uma pinça (Figura 11 d), o punho é dobrado (Figura 6C, direita). Uma pequena alç...

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Este estudo apresenta procedimentos confiáveis e fácil de obtenção de seções ultra-finas seriais de um microorganismo sem equipamentos caros em microscopia eletrônica de transmissão.

Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

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