Name: a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00
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Agradecemos sinceramente a Shigeo Kita por sus valiosas sugerencias y discusión. También agradecemos a John y Sumire Eckstein para su lectura crítica del manuscrito.

Nota: Los especímenes utilizados en este estudio fueron microorganismos, propano rápidamente congelados en nitrógeno líquido, congelarán substituido en acetona que contiene tetróxido de osmio 2% y embebidos en resina epoxy1,2,3, 4,5,6,7,8,...

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+ultrastructure+of+yeast+cells+by+electron+microscopy.">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy.">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Exophiala+yeast+cells+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li><li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density.">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li><li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis,+which+survives+with+only+700+ribosomes+at+density+per+0.1+fl+cytoplasm.">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea.">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryote+or+eukaryote?+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea.">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning+of+the+Myojin+parakaryote+discovered+in+the+deep+sea.">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-sea+microorganisms+and+the+origin+of+the+eukaryotic+cell.">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+microorganisms:+from+influenza+virus+to+deep-sea+microorganisms.">An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms.</a> JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+specimen+preparation+for+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+of+yeast+cells.">Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells.</a> J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis+cell+by+freeze-substitution+and+serial+sectioning+electron+microscopy.">Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).</li><li>Kozubowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+kinetochore+assembly+in+the+human+pathogenic+basidiomycetous+yeast,+Cryptococcus+neoformans.">Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans.</a> mBio. 4, e00614-e00613 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+support.">Specimen support.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).</li><li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+films.">Support films.</a> Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).</li><li>Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning.">Ultrathin sectioning.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+hydrophilicity/hydrophobicity+of+the+plasma-polymerized+naphthalene+film+(Super+support+film)+and+other+support+films+and+grids+in+electron+microscopy.">Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy.</a> Microscopy. 65, 444-450 (2016).</li><li>Kita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+using+new+small+tools.">Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools.</a> Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+use+of+uranyl+acetate+solution+in+section+staining+in+transmission+electron+microscopy.">Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy.</a> Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).</li><li>Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+collection+of+ultrathin+serial+sections+for+large+volume+TEM+reconstructions.">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).</li><li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

El método presentado aquí no requiere de costoso equipo. Requiere sólo un bastidor de aluminio (figura 3), hendidura de tres rejillas (figura 6 c), sección explotación bucles (figura 10a), lazo de aumento de superficie de agua (figura 11a) y un tubo de tinción (figura 13). Hay muchas características del método actual. Gran parte de la muestra se utiliza para ajustar...

Técnica de seccionamiento ultrafina serie adecuada es indispensable para el estudio de las células y los componentes de la célula tridimensionalmente en el nivel microscópico de electrones. Hemos estudiado la dinámica del cuerpo de polo del huso en el ciclo celular de las células de levadura y reveló cambios morfológicos de su ultraestructura durante el ciclo celular y el tiempo de duplicación1,2,3, 4,5. En 2006, acuñó una nueva palabra 'structome' mediante la combinación de 'estructura' y '-ome' y se define como la 'información cuantitativa y tridimensional estructural de una célula entera en el nivel microscópico de electrones' 6,7.
Por el análisis de structome, que requiere técnica de seccionamiento ultrafino serial, se encontró que una célula de levadura de Saccharomyces cerevisiae y Exophiala dermatitidis tenía unos 200.000 ribosomas7,8, un Escherichia coli celular tenía 26.000 ribosomas9, un celular de la Mycobacterium tuberculosis tenía 1.700 ribosomas10 y bacterias en espiral Myojin tenían los ribosomas sólo 30011. Esta información es útil en la estimación no solo de la tasa de crecimiento en cada organismo, pero también en la identificación de especies9.
Además, structome análisis conducido al descubrimiento de un nuevo organismo; Parakaryon myojinensis fue encontrado en el mar frente a las costa de Japón, cuya estructura de la célula fueron un intermedio entre los de procariotas y eucariotas,12,13,14,15. En la actualidad, serie técnica de seccionamiento ultrafino se considera tan difícil que tomaría mucho tiempo al maestro. En este estudio, hemos desarrollado un método fiable en la que cualquiera puede realizar seccionamiento ultrafino serial sin dificultad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Formvar making apparatus</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>652</td>
			<td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>-</td>
			<td>76 x 26 x 1.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum rack with 4-mm holes</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>658</td>
			<td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic trimming blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesa cut</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit nickel grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2458</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit copper grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2459</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Section-holding loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>526</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-surface-raising loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>527</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining tube</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-specimen holder</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>EM-11170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

Observación de células y componentes de la célula en tres dimensiones en el gran aumento en microscopía electrónica de transmisión requiere la preparación de secciones ultrafinas seriales de la muestra. Aunque la preparación de secciones ultrafinas seriales es considerado como muy difícil, es bastante fácil si se utiliza el método apropiado. En este documento, se muestra un procedimiento paso a paso para la obtención segura de las secciones ultrafinas seriales de microorganismos. Los puntos claves de este método son: 1) a utilizar gran parte de la muestra y ajustar el borde de la superficie y cuchillo de muestra para que sean paralelas entre sí; 2) para cortar secciones seriales en grupos y evitar dificultades en la separación de las secciones con un par de mechones de pelo al recuperar un grupo de secciones seriadas en las rejillas de ranura; 3) usar un 'lazo de retención de sección' y evitar mezclar el orden de los grupos de sección; 4) para utilizar un bucle de aumento de superficie de agua y asegúrese de que las secciones se colocan en el ápice del agua y que tocan la red en primer lugar, con el fin de colocarlos en la posición deseada sobre las rejillas; 5) para utilizar la película de soporte en un bastidor de aluminio y que sea más fácil recuperar las secciones en las rejillas y evitar el arrugamiento de la película de soporte; y 6) a utilizar un tubo de coloración y evitar romper accidentalmente las películas de soporte con las pinzas. Este nuevo método permite obtener secciones seriadas ultrafinas sin dificultad. El método permite analizar las estructuras celulares de los microorganismos en alta resolución en 3D, que no puede lograrse mediante el método automático de recogida de cinta ultramicrótomo y serie bloque-cara o viga de ion enfocada microscopía electrónica de barrido.

En este protocolo, rejillas de ranura en tres fueron utilizadas para recoger las secciones seriales. Las redes están hechas de níquel o cobre. Las secciones seriales se colocan en la ranura central. Las ranuras en ambos lados son necesarias para ver las secciones al aspirar con la rejilla. Para mantener las rejillas paralelas con secciones seriales al recoger con las pinzas (figura 11 d), el mango se dobla (figura 6 c, derecha)...

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Este estudio presenta procedimientos confiables y fáciles para la obtención de secciones ultrafinas seriales de un microorganismo sin equipo costoso en microscopía electrónica de transmisión.

Un método para la obtención de secciones seriadas ultrafinas de microorganismos en microscopía electrónica de transmisión

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