Name: mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra grant af fremragende videnskabsmand af Shandong (JQ201421) og tilskud fra NSFC (81371226).

1. isolering af mitochondrier
Bemærk: Alle løsninger og udstyr bør være forkølede til 0 - 4 ° C og opbevares på is.
<ol><li>Frø omkring 3 x 106 SH-SY5Y celler pr. 10 cm celle kultur parabol. Kultur celler i høj-glucose Dulbecco ændrede Eagle medium med 10% føtal bovint serum, penicillin (100 U/mL)-streptomycin (100 µg/mL). Vedligeholde ved 37 ° C i en inkubator indeholdende 5% CO2 natten over. Bemærk: mindst 1-2 x 107 SH-SY5Y celler er nødve...

<ol>
	<li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+respiratory+stimulation,+accumulation+of+Ca+++and+phosphate,+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria.">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li><li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+transport:+mechanisms+and+functions.">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li><li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling.">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li><li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+in+neuronal+degeneration.">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+green-5N,+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2++concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons.">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li><li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations.">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li><li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons.">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling,+oxidative+cell+death,+and+reperfusion+injury.">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li><li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+calcium+levels+(Rhod-2+fluorescence)+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death.">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li><li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size,+flow+cytometric+parameters,+and+ultrastructure.">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li><li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay:+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation.">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li><li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+permeability+transition+pore,+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A.">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li><li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li><li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca(2+)+transport+mechanisms.">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li></ol>

Her, vi beskrevet en enkel og effektiv protokol til mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet analysen og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse assay.
Til mitokondrie isolering, Sørg for at alle materialer og rør er på isen, især når homogenisering cellerne. 0,25% trypsin-EDTA kan også bruges til at løsne celler fra fad i 5 min ved 37 ° C. Efter 15-25 slag er det nødvendigt at observere intakt cellemembranen under mikroskop og undgå brud af mitokondrier membran. Me...

Mitokondrier er de vigtigste cellulære organer til at producere næsten 95% af ATP anvendes i de pattedyrceller ved oxidativ fosforylering. Det forlyder, at den afsondret micromolar koncentration af Ca2 + af mitokondrier, tilstedeværelse af ADP og uorganisk fosfat kan bruges til at phosphorylate ADP at syntese ATP1. Når koncentrationen af cytosole Ca2 + går over en tærskel, mitokondrier kan optagelsen Ca2 + hurtigt og efflux det langsomt. Således, de fungerende mitokondrier kan tilstrømning af øget cytosole Ca2 +. Irrelevant for deltagelse i oxidativ fosforylering, den mitokondrielle Ca2 + også tage del i de cytosole calciumsignaler og aktivere mitokondriets apoptotiske mekanisme ved at inducere åbningen af mPTP i den indre mitokondrielle membran2. Det har været almindeligt anerkendt, at unormale udvidelse af intracellulære Ca2 + kan fremkalde mitokondrie massive hævelse ved at åbne mPTP3. Således, denne protokol har til formål at vurdere den mitokondrielle funktion af kvantificere mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +-trigget mitokondrier hævelse.
Ca2 + fastholdelse kapacitet er måling af mitokondrier evne til optagelse cytosole calcium. Mitokondrier kan buffer cytosole gratis calcium og regulere calcium-afhængige cellulære processer af calcium optagelse i form af inaktive bundfald. Nedsat Ca2 + fastholdelse kapacitet opstår i stress fænomener forbundet med energi begrænsning og endda neurodegenerative sygdomme4,5. Isolerede mitochondrier eller digitonin-permeabilized celler kan bruges til at identificere Ca2 + fastholdelse kapacitet, og den forhøjede evne til at akkumulere Ca2 + af isolerede mitochondrier med yderligere glutamat og malat ikke er foretaget af den mitokondrie isolation procedure6. En titreret mængden af digitonin bør anvendes til at permeabilize plasma membraner i forskellige celletyper. Hexapotassium salt af Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof, en Ca2 +-følsomme celle-impermeant synligt lys-overgearet indikator, har været udbredte7. Ca2 +-bindende grøn fluorescerende farvestof er en indikator for lav-affinitet og bruges til at vise, at intracellulære gratis Ca2 + koncentrationer fortsætter med at stige i løbet af langvarig (5 min) stimulering8. Denne metode var mindre følsomme end radioaktive filter teknik, men var stærkt forenklet. Den yderligere Ca2 + hæver calcium grønne fluorescens og Ca2 + optagelse af mitokondrier returnerer fluorescens grundlinjen. Sekventiel tilføjelser af Ca2 + blev foretaget indtil mitokondrier undladt at optagelsen extramitochondrial Ca2 + 9. En fluorescens mikrotiterplade læser kan bruges til løbende rapportere calcium grønne fluorescens.
Efter Ca2 + akkumulering, mitokondrier depolariseret, udgivet Ca2 + til mediet, og begyndte at svulme. Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse bruges til at angive mPTP åbning. Elektronmikroskopi og faldet i lys absorbans ved 540 nm kan bruges til at måle Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse10,11. Mitokondrier volumen kan bestemmes direkte ved fremadrettet vinkel lysspredning12, hvor falder i absorbansen afspejler passiv hævelse af den mitokondriets matrix.
Her viser vi metoden for at undersøge den mitokondrielle Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse i isolerede mitochondrier fra SH-SY5Y celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cell line</td>
			<td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td>
			<td>ATCC Number: CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium green-5N</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>c-3737</td>
			<td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete protease inhibitors</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass homogenizer</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>9885303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES5063G-A7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46940-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>00457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan flash instruments</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IC100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bongkrekate</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>1820-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atractyloside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-glucose Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022</td>
			<td>4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11860-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NCI3225CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay

Produktionen af ATP ved oxidativ fosforylering er den primære funktion af mitokondrier. Mitokondrier i højere eukaryoter også deltage i cytosole Ca2 + buffer, og ATP produktion i mitokondrie kan være medieret af intramitochondrial gratis Ca2 + koncentration. Ca2 + fastholdelse kapacitet kan betragtes som mitokondrier evne til at bevare calcium i mitokondriets matrix. Akkumulerede intracellulære Ca2 + fører til permeabilitet af den indre mitokondrielle membran kaldes åbningen af mitokondrie permeabilitet overgangen pore (mPTP), hvilket fører til lækage af molekyler med en Molekylær vægt mindre end 1,5 kDa. Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse bruges til at angive mPTP åbning. Her beskriver vi to assays for at undersøge Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse i isolerede mitochondrier. Efter visse mængder af Ca2 + er tilføjet, kan alle trin udfyldes på én dag og indspillet af en mikrotiterplade læser. Således, disse to enkle og effektive assays kan vedtages for at vurdere Ca2 +-relaterede mitokondriets funktioner.

Repræsentative resultater af Ca2 + fastholdelse kapacitet: Resultaterne blev udtrykt som fluorescens værdier. Med de ekstra pulser af Ca2 + (200 nmols/mg mitokondrie protein), fluorescens steg med dobbelt over baseline med mPTP åbning. 5 μM Bongkrekate (BKA), en hæmmer af Ca2 +-induceret mPTP åbning eller 1 μM atractyloside (ATR), en aktivator af Ca2 +-induceret mPTP åbning, blev tilføjet i isolerede mitochondrier. Mængden ...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay at JoVE.com

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet analysen og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse Assay

Denne protokol har til formål at beskrive en metode til at undersøge Ca2 + fastholdelse kapacitet og Ca2 +- udløst mitokondrier hævelse af isolerede mitochondrier af SH-SY5Y celler trin for trin.

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Evaluering af bioenergetic Funktion i cerebrale vaskulære endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay udvikling for høje indhold kvantificering af Sod1 Mutant Protein samlede dannelse i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analyse mitokondriel transport og morfologi i Human Induceret pluripotente stamceller-afledte neuroner i arvelige spastiske paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Generation af humane hjerneorganoider til mitokondriesygdom Modellering

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Bestemmelse af mitokondrie respiration og glykolyse i Ex Vivo Retinal vævsprøver

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

Imaging Mitokondrie Ca2 + Optagelse i astrocytter og neuroner ved hjælp af genetisk kodede Ca2 + Indikatorer (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

Live-imaging af Mitokondrie System i kultiverede astrocytter

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...