Name: mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00
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इस अध्ययन के अनुदान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया शेडोंग के बकाया वैज्ञानिक (JQ201421) और अनुदान से NSFC (८१३७१२२६).

1. Mitochondria का अलगाव
नोट: सभी समाधान और उपकरणों 0-4 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा किया जाना चाहिए और बर्फ पर रखा ।
<ol><li>बीज के बारे में 3 x 106 श-SY5Y कोशिकाओं प्रति 10 सेमी सेल संस्कृति डिश । उच्च ग्लूकोज Dulbecco ?...

<ol>
	<li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+respiratory+stimulation,+accumulation+of+Ca+++and+phosphate,+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria.">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li><li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+transport:+mechanisms+and+functions.">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li><li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling.">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li><li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+in+neuronal+degeneration.">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+green-5N,+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2++concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons.">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li><li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations.">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li><li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons.">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling,+oxidative+cell+death,+and+reperfusion+injury.">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li><li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+calcium+levels+(Rhod-2+fluorescence)+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death.">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li><li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size,+flow+cytometric+parameters,+and+ultrastructure.">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li><li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay:+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation.">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li><li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+permeability+transition+pore,+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A.">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li><li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li><li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca(2+)+transport+mechanisms.">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li></ol>

यहां, हम mitochondrial ca2 + प्रतिधारण क्षमता परख और ca2 +ट्रिगर mitochondrial सूजन परख के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन किया ।
mitochondrial अलगाव के लिए, सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री और ट्यूबों बर्फ पर ?...

Mitochondria मुख्य सेलुलर अंगों ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में इस्तेमाल एटीपी के लगभग ९५% उत्पादन कर रहे हैं । यह सूचना दी है कि तनहा micromolar की एकाग्रता2 + द्वारा mitochondria, adp की उपस्थिति, और अकार्बनिक फॉस्फेट phosphorylate करने के लिए adp एटीपी1करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब cytosolic ca की एकाग्रता2 + एक दहलीज के ऊपर चला जाता है, mitochondria सीए2 + तेजी से तेज और समाप्ति इसे धीरे से कर सकते हैं । इस प्रकार, कामकाजी mitochondria बढ़ cytosolic Ca2 +आमद कर सकते हैं । ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण में भागीदारी के लिए अप्रासंगिक, mitochondrial Ca2 + भी cytosolic कैल्शियम संकेतों में भाग लेने के लिए और mitochondrial अपोप्तोटिक तंत्र को सक्रिय mPTP के भीतर mitochondrial के उद्घाटन के लिए प्रेरित करके झिल्ली2. यह व्यापक रूप से मांयता प्राप्त है कि intracellular Ca के असामांय उंनयन2 + mPTP3खोलने के द्वारा mitochondrial बड़े पैमाने पर सूजन पैदा कर सकता है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को mitochondrial ca2 + प्रतिधारण क्षमता और ca2 +-trigged mitochondrial सूजन को बढ़ाता द्वारा mitochondrial समारोह का आकलन करना है ।
Ca2 + प्रतिधारण क्षमता cytosolic कैल्शियम mitochondria की क्षमता का माप है । Mitochondria cytosolic मुक्त कैल्शियम बफर कर सकते हैं और निष्क्रिय हाला के रूप में कैल्शियम के साथ कैल्शियम पर निर्भर सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित. बिगड़ा Ca2 + प्रतिधारण क्षमता ऊर्जा सीमा और भी neurodegenerative रोगों4,5के साथ जुड़े तनाव घटना में होता है । पृथक mitochondria या digitonin-permeabilized कक्षों को ca2 + अवधारण क्षमता, और additonal ग्लूटामेट और malate के साथ पृथक mitochondria द्वारा ca2 + को संचित करने की उंनत क्षमता को पहचानने के लिए उपयोग किया जा सकता है mitochondrial आइसोलेशन प्रक्रिया6। digitonin का एक titrated मात्रा में विभिन्न कोशिका प्रकार के प्लाज्मा झिल्ली permeabilize करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । ca के hexapotassium नमक2 +-हरी फ्लोरोसेंट डाई बाध्यकारी, एक ca2 +-संवेदनशील कोशिका-impermeant दृश्य प्रकाश उत्तेजित सूचक, व्यापक रूप से किया गया है7। ca2 +-हरी फ्लोरोसेंट डाई बाध्यकारी एक कम आत्मीयता सूचक है और दिखाने के लिए कि intracellular नि: शुल्क Ca2 + सांद्रता को लंबे समय तक (5 मिनट) उत्तेजना8के दौरान वृद्धि जारी रखने के लिए इस्तेमाल किया । इस विधि रेडियोधर्मी फिल्टर तकनीक की तुलना में कम संवेदनशील था, लेकिन बहुत सरल था । अतिरिक्त ca2 + उंनयन कैल्शियम ग्रीन प्रतिदीप्ति और ca2 + mitochondria द्वारा ले आधारभूत करने के लिए प्रतिदीप्ति रिटर्न । ca2 + के अनुक्रमिक जोड़ दिया गया जब तक mitochondria extramitochondrial ca2 + 9के लिए असफल । कैल्शियम ग्रीन प्रतिदीप्ति को लगातार रिपोर्ट करने के लिए एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
ca के बाद2 + संचय, mitochondria, विमोचन ca2 + माध्यम में जारी किया है, और प्रफुल्लित करने के लिए शुरू किया । सीए2 +-ट्रिगर mitochondria सूजन mPTP खोलने का संकेत करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और ५४० एनएम पर प्रकाश अवशोषक में कमी के लिए सीए2 +ट्रिगर mitochondrial सूजन10,11मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Mitochondria मात्रा सीधे आगे कोण प्रकाश कैटरिंग12, जहां अवशोषण में कमी mitochondrial मैट्रिक्स की निष्क्रिय सूजन को प्रतिबिंबित द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ।
यहां, हम mitochondrial ca की जांच करने के लिए पद्धति उदाहरण देकर स्पष्ट2 + प्रतिधारण क्षमता और ca2 +-ट्रिगर mitochondrial SY5Y कोशिकाओं से पृथक mitochondria में सूजन ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cell line</td>
			<td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td>
			<td>ATCC Number: CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium green-5N</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>c-3737</td>
			<td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete protease inhibitors</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass homogenizer</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>9885303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES5063G-A7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46940-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>00457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan flash instruments</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IC100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bongkrekate</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>1820-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atractyloside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-glucose Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022</td>
			<td>4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11860-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NCI3225CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay

ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण द्वारा एटीपी का उत्पादन mitochondria का प्राथमिक कार्य है. उच्च eukaryotes में Mitochondria भी cytosolic ca2 + buffering में भाग लेते हैं, और mitochondrial में एटीपी उत्पादन intramitochondrial मुक्त Ca2 + एकाग्रता द्वारा मध्यस्थता कर सकते हैं । Ca2 + प्रतिधारण क्षमता mitochondrial मैट्रिक्स में कैल्शियम बनाए रखने के लिए mitochondria की क्षमता के रूप में माना जा सकता है । संचित intracellular Ca2 + भीतरी mitochondrial झिल्ली की पारगम्यता की ओर जाता है, mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना (mPTP) के उद्घाटन, जो एक आणविक वजन से कम १.५ केडीए के साथ अणुओं के रिसाव की ओर जाता है. सीए2 +-ट्रिगर mitochondria सूजन mPTP खोलने का संकेत करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यहां, हम दो परख का वर्णन करने के लिए ca की जांच2 + प्रतिधारण क्षमता और ca2 +-ट्रिगर mitochondrial अलग mitochondria में सूजन । कुछ मात्रा के बाद Ca2 + जोड़े जाते हैं, सभी चरणों एक दिन में पूरा किया जा सकता है और एक microplate रीडर द्वारा दर्ज की गई । इस प्रकार, इन दो सरल और प्रभावी परख के लिए सीए2 +-संबंधित mitochondrial कार्यों का आकलन अपनाया जा सकता है ।

सीए के प्रतिनिधि परिणाम2 + प्रतिधारण क्षमता: परिणाम प्रतिदीप्ति मूल्यों के रूप में व्यक्त किए गए. सीए के अतिरिक्त दालों के साथ2 + (२०० nmols/मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन), प्रतिदीप्ति mPTP ख?...

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Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial ca2 + प्रतिधारण क्षमता परख और ca2 +ट्रिगर Mitochondrial सूजन परख

इस प्रोटोकॉल के लिए एक विधि का वर्णन करने के लिए ca की जांच करने के लिए2 + प्रतिधारण क्षमता और ca2 +-ट्रिगर mitochondrial के अलग mitochondria के सूजन-SY5Y कोशिकाओं कदम दर कदम ।

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