Name: mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da parte di grant della eccezionale scienziato dello Shandong (JQ201421) e grant da NSFC (81371226).

1. isolamento dei mitocondri
Nota: Tutte le soluzioni e apparecchiature dovrebbe essere preraffreddate a 0 - 4 ° C e tenute su ghiaccio.
<ol><li>Seme circa 3 x 106 SH-SY5Y cellule per piastra di coltura delle cellule di 10 cm. Cellule di cultura in alto-glucosio Dulbecco s modified medium di Eagle con 10% siero bovino fetale, penicillina (100 U/mL)-streptomicina (100 µ g/mL). Mantenere a 37 ° C in un incubatore contenente 5% CO2 durante la notte. Nota: almeno 1-2 ...

<ol>
	<li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+respiratory+stimulation,+accumulation+of+Ca+++and+phosphate,+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria.">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li><li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+transport:+mechanisms+and+functions.">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li><li>Crofts, A. R., Chappell, J. 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Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li><li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+in+neuronal+degeneration.">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+green-5N,+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2++concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons.">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li><li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations.">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li><li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons.">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling,+oxidative+cell+death,+and+reperfusion+injury.">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li><li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+calcium+levels+(Rhod-2+fluorescence)+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death.">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li><li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size,+flow+cytometric+parameters,+and+ultrastructure.">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li><li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay:+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation.">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li><li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+permeability+transition+pore,+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A.">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li><li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li><li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca(2+)+transport+mechanisms.">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li></ol>

Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice ed efficace per il mitocondriale Ca2 + ritenzione capacità dosaggio e Ca2 +-attivato dosaggio gonfiamento mitocondriale.
Per l'isolamento mitocondriale, assicurarsi che tutti i materiali e i tubi sono sul ghiaccio, soprattutto quando le cellule di omogeneizzazione. 0,25% tripsina-EDTA può essere utilizzato anche per staccare le cellule dal piatto per 5 min a 37 ° C. Dopo 15-25 colpi, è necessario osservare la membrana dell...

I mitocondri sono i principali organi cellulari per produrre quasi il 95% del trifosfato di adenosina usato nelle cellule dei mammiferi di fosforilazione ossidativa. È stato riferito che la concentrazione micromolar sequestrata di Ca2 + dai mitocondri, la presenza di ADP e fosfato inorganico può essere utilizzato per fosforilare ADP a sintesi ATP1. Quando la concentrazione di Ca citosolico2 + supera una soglia, i mitocondri possono l'assorbimento di Ca2 + rapidamente e di efflusso e lentamente. Così, i mitocondri di funzionamento possono afflusso l'aumento citosolico Ca2 +. Irrilevante per la partecipazione nella fosforilazione ossidativa, il mitocondriale Ca2 + anche partecipare i segnali di calcio citosolico e attivare il meccanismo apoptotico mitocondriale inducendo l'apertura della mPTP nella parte interna mitocondriale membrana2. È stato ampiamente riconosciuto che l'elevazione anormale del intracellulare di Ca2 + può indurre mitocondriale gonfiamento voluminoso aprendo il mPTP3. Così, questo protocollo ha lo scopo di valutare la funzione mitocondriale di quantificare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale.
Capacità di ritenzione di CA2 + è la misura della capacità dei mitocondri di calcio citosolico di assorbimento. I mitocondri possono buffer il calcio libero citosolico e regolano i processi cellulari di calcio-dipendente dall'assorbimento di calcio sotto forma di precipitati inattivi. Capacità di ritenzione alterata Ca2 + si verifica nei fenomeni di stress associati a limitazione di energia e anche neurodegenerative malattie4,5. Mitocondri isolati o cellule della digitonina-permeabilized possono essere utilizzate per identificare la capacità di ritenzione di Ca2 + , e l'elevata capacità di accumulare Ca2 + di mitocondri isolati con il glutammato additonal e malate non avviene mediante il isolamento mitocondriale procedura6. Una quantità di Estratto titolata di digitonina deve essere utilizzata per permeabilize le membrane del plasma di diversi tipi di cellule. Il sale di hexapotassium di Ca2 +-associazione tintura fluorescente verde, Ca2 +-indicatore luce-eccitabile visibile cellula-impermeant sensibile, è stato ampiamente usato7. CA2 +-associazione verde colorante fluorescente è un indicatore di bassa affinità e utilizzati per dimostrare che intracellulare Ca2 + le concentrazioni libere di continuare ad aumentare durante prolungato di stimolazioni (5 min)8. Questo metodo era meno sensibile che la tecnica di filtro radioattivo, ma è stato notevolmente semplificato. Ulteriori Ca2 + eleva fluorescenza verde di calcio e l'assorbimento di Ca2 + dai mitocondri ritorna la fluorescenza ai valori basali. Fino a quando i mitocondri non è riuscito a assorbimento extramitochondrial Ca2 + 9, sono state fatte aggiunte sequenziale di Ca2 + . Un lettore di micropiastre di fluorescenza può essere utilizzato per segnalare continuamente la fluorescenza verde di calcio.
Dopo Ca2 + accumulo, mitocondri depolarizzarono, scaricata Ca2 + nel terreno e ha cominciato a gonfiarsi. CA2 +-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. La microscopia elettronica e la diminuzione di luce assorbanza a 540 nm può essere usato per misurare il Ca2 +-innescato mitocondriale gonfiore10,11. Volume di mitocondri può essere determinata direttamente da angolo in avanti dispersione della luce12, dove diminuisce di assorbanza riflettono passiva gonfiore della matrice mitocondriale.
Qui, vi illustriamo la metodologia per esaminare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cell line</td>
			<td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td>
			<td>ATCC Number: CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium green-5N</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>c-3737</td>
			<td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete protease inhibitors</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass homogenizer</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>9885303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES5063G-A7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46940-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>00457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan flash instruments</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IC100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bongkrekate</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>1820-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atractyloside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-glucose Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022</td>
			<td>4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11860-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NCI3225CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay

La produzione di ATP da fosforilazione ossidativa è la funzione primaria dei mitocondri. I mitocondri negli eucarioti superiori partecipano anche Ca citosolico2 + buffer, e la produzione di ATP in mitocondriale può essere mediata da intramitochondrial Ca2 + concentrazione libera. Capacità di ritenzione di CA2 + può essere considerata come la capacità dei mitocondri di trattenere calcio nella matrice mitocondriale. Accumulato intracellulare Ca2 + conduce alla permeabilità della membrana mitocondriale interna, definito l'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mPTP), che conduce alla perdita di molecole con un molecolare peso meno di 1,5 kDa. CA2 +-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l'apertura di mPTP. Qui, descriviamo due saggi per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati. Dopo determinate quantità di Ca2 + vengono aggiunti, tutti i passaggi possono essere completati in un giorno e registrati da un lettore di micropiastre. Così, queste due analisi semplice ed efficace possono essere adottate per valutare il Ca2 +-relative funzioni mitocondriali.

Rappresentante risultati di Ca2 + capacità di ritenzione: Risultati sono stati espressi come valori di fluorescenza. Con gli ulteriori impulsi del Ca2 + (200 proteina mitocondriale nmols/mg), la fluorescenza aumentata del doppio di sopra della linea di base con l'apertura di mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inibitore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, o 1 μM atractyloside (ATR), un attivatore di Ca2 +-indotto mPTP apertura, sono stat...

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Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitocondriale di Ca2 + ritenzione capacità Assay e Ca2 +-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

Questo protocollo ha lo scopo di descrivere un metodo per esaminare la capacità di ritenzione di Ca2 + e Ca2 +- innescato mitocondriale gonfiore di mitocondri isolati di SH-SY5Y cellule passo-passo.

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Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

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