Name: mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00
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本研究は、山東省卓越した科学者 (JQ201421) と NSFC (81371226) からの助成金の助成金からの助成金によって支えられました。

1. ミトコンドリアの分離
注: すべてのソリューションや機器 0 - 4 ° C に冷却、氷で保たれます。
<ol><li>10 cm 細胞培養ディッシュあたり種子約 3 x 10 の6 SH SY5Y 細胞。高グルコース ダルベッコの培養細胞の 10% 牛胎児血清ペニシリン (100 U/mL) とイーグル培地、変更された-ストレプトマイシン (100 μ g/mL)。一晩 5% CO2を含むインキュベーターで 37 ° C で維持し?...

<ol>
	<li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+respiratory+stimulation,+accumulation+of+Ca+++and+phosphate,+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria.">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li><li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+transport:+mechanisms+and+functions.">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li><li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling.">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li><li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+in+neuronal+degeneration.">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+green-5N,+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2++concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons.">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li><li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations.">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li><li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons.">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling,+oxidative+cell+death,+and+reperfusion+injury.">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li><li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+calcium+levels+(Rhod-2+fluorescence)+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death.">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li><li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size,+flow+cytometric+parameters,+and+ultrastructure.">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li><li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay:+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation.">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li><li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+permeability+transition+pore,+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A.">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li><li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li><li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca(2+)+transport+mechanisms.">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li></ol>

ここでは、我々 はミトコンドリアの Ca2 +の保持の能力分析と Ca2 +のシンプルで効果的なプロトコルを記述した-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガーされます。
ミトコンドリアの分離セルを均質化する場合は特にすべての材料およびチューブは氷の上が存在することを確認します。0.25% トリプシン-EDTA は、37 ° C で 5 分間料理から細胞を切り離す場合...

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化による哺乳類細胞で使用される ATP の約 95% を生産する主要な細胞器官です。合成 ATP1に ADP をリン酸化して使用できます、ADP と無機リン酸の存在、人里離れたマイクロモル濃度 Ca2 +ミトコンドリアによって報告されます。細胞内 Ca2 +濃度がしきい値を超えると、ミトコンドリアが取り込み Ca2 +急速および流出それゆっくり。したがって、機能しているミトコンドリアは、増加した細胞内 Ca2 +の流入をことができます。無関係酸化的リン酸化に関与する、ミトコンドリア Ca2 +もゾル性細胞質カルシウム信号の部分を取るし、mPTP のミトコンドリアの内側の開口部を誘導することによってミトコンドリアを介したアポトーシスのメカニズムをアクティブにします。膜2。細胞内 Ca2 +の異常上昇が mPTP3を開くことによってミトコンドリアの大規模な腫れを引き起こすことができる広く認識されています。したがって、このプロトコルがミトコンドリアの Ca2 +保持能力と Ca2 +を定量化することでミトコンドリアの機能を評価することを目的-ミトコンドリアの膨潤が起きるというものです。
Ca2 +保持能力ゾル性細胞質カルシウムを摂取するミトコンドリアの機能の測定であります。ミトコンドリアは細胞内遊離カルシウムをバッファーし、使用頻度の低い沈殿物の形でカルシウム摂取によってカルシウム依存性細胞プロセスを調整できます。障害者 Ca2 +保持能力にエネルギー制限とも神経変性疾患4,5に関連するストレス現象に発生します。ミトコンまたはジギトニン グリセリン細胞 Ca2 +保持能力を識別するために使用できます、追加グルタミン酸とリンゴ酸分離ミトコンドリアによる Ca2 +を蓄積する高い能力は受けない、ミトコンドリアの分離手順6。ジギトニンの滴定された量を使用して、異なる種類の細胞の細胞膜を permeabilize ください。Hexapotassium 塩 Ca2 +-緑色蛍光染料、Ca2 +の結合-敏感な細胞非透過性可視光興奮インジケーターは、広く使用されている7をされています。Ca2 +-(5 分) 刺激8延長バインド緑蛍光染料は低親和性インジケーターで、無料の細胞内 Ca2 +濃度が上昇し続けることを示すために使用します。このメソッドは、放射性フィルター技術よりも敏感だったが、大幅に簡略化します。追加 Ca2 +カルシウム緑色蛍光を高め、ミトコンドリアの Ca2 +吸収がベースラインに蛍光を返します。逐次追加の Ca2 +は、ミトコンドリア吸収 extramitochondrial Ca2 + 9に失敗するまで行われました。蛍光マイクロ プレート リーダーは、継続的にカルシウム緑色蛍光を報告する使用できます。
Ca2 +蓄積の後、ミトコンドリアが脱分極し、中に Ca2 +放出ははれだした。Ca2 +-腫れ、mPTP 開口部を示すためミトコンドリアをトリガーします。電子顕微鏡、Ca2 +の測定に使用に 540 nm の吸光度の減少-ミトコンドリアの膨潤10,11をトリガーします。前方角度光散乱で12、吸光度の減少がミトコンドリアのマトリックスの受動的な腫れを反映ミトコンドリア ボリュームを直接的に確認することができます。
ここで、我々 はミトコンドリアの Ca2 +保持能力と Ca2 +を検討する方法論を説明-SH SY5Y 細胞から分離ミトコンドリア ミトコンドリアの膨潤をトリガーします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cell line</td>
			<td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td>
			<td>ATCC Number: CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium green-5N</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>c-3737</td>
			<td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete protease inhibitors</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass homogenizer</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>9885303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES5063G-A7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46940-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>00457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan flash instruments</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IC100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bongkrekate</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>1820-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atractyloside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-glucose Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022</td>
			<td>4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11860-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NCI3225CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay

酸化的リン酸化による ATP の生産は、ミトコンドリアの主要な機能です。高等真核生物のミトコンドリアは細胞内 Ca2 +のバッファリングにも参加し、ミトコンドリアで、ATP を生産することができます無料のミトコンドリア内 Ca2 +濃度によって媒介されます。Ca2 +保持能力は、ミトコンドリアのマトリックスでカルシウムを保持するミトコンドリアの機能としてみなすことができます。蓄積された細胞内 Ca2 +の内ミトコンドリア膜透過性につながるでは、ミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP)、分子と分子の漏れにつながる重量未満 1.5 kDa の開口部と呼ばれます。Ca2 +-腫れ、mPTP 開口部を示すためミトコンドリアをトリガーします。ここで、Ca2 +保持能力と Ca2 +を検討する 2 つの試金を記述-分離ミトコンドリア ミトコンドリアの膨潤をトリガーします。一定量に Ca2 +が追加されますすべての手順を実行することができます 1 日で完了なりマイクロ プレート リーダーによって記録されました。したがって、これら 2 つのシンプルで効果的なアッセイを採用して、Ca2 +を評価できる-関連するミトコンドリアの機能。

Ca2 +保持能力の代表の結果: 結果は、蛍光値として表現されました。Ca2 + (200 nmols/mg ミトコンドリア蛋白質)、mPTP 開口基準上増蛍光付加パルス。5 μ M Bongkrekate (BKA)、Ca2 +の阻害剤-mPTP が開いたり、1 μ M atractyloside (ATR)、Ca2 +の活性化を誘導-mPTP オープニングを誘発、ミトコン ドリアにしました。合計追加 Ca2 +ベースライ?...

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Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

ミトコンドリアの Ca2 +保持容量測定と Ca2 +-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

このプロトコルが Ca2 +保持能力と Ca2 +を調べる方法を説明することを目的 - トリガー SH SY5Y 分離ミトコンドリアの膨潤ミトコンドリア細胞ステップバイ ステップ。

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