Name: mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay at JoVE.com

Denne studien ble støttet av tilskudd fra grant fremragende vitenskapsmann Shandong (JQ201421) og støtte fra NSFC (81371226).

1. isolering av mitokondrier
Merk: Alle løsninger og utstyr skal være forkjøles og lagres til 0 - 4 ° C og holdt på is.
<ol><li>Frø ca 3 x 106 SH-SY5Y celler per 10 cm celle kultur parabol. Kultur celler i høy-glukose Dulbecco modifiserte Eagle medium med 10% fosterets bovin serum, penicillin (100 U/mL)-streptomycin (100 µg/mL). Opprettholde på 37 ° C i en inkubator inneholder 5% CO2 over natten. Merk: minst 1-2 x 107 SH-SY5Y celler kreves for hv...

<ol>
	<li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+respiratory+stimulation,+accumulation+of+Ca+++and+phosphate,+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria.">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li><li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+transport:+mechanisms+and+functions.">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li><li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling.">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li><li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+in+neuronal+degeneration.">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+green-5N,+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2++concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons.">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li><li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations.">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li><li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons.">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling,+oxidative+cell+death,+and+reperfusion+injury.">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li><li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+calcium+levels+(Rhod-2+fluorescence)+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death.">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li><li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size,+flow+cytometric+parameters,+and+ultrastructure.">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li><li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay:+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation.">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li><li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+permeability+transition+pore,+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A.">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li><li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li><li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca(2+)+transport+mechanisms.">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li></ol>

Her vi beskrev en enkel og effektiv protokoll for mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet analysen og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse analysen.
For mitokondrie isolasjon, sikre at alle materialer og rør er på is, spesielt når homogenisere cellene. 0.25% trypsin-EDTA kan også brukes til å koble celler fra parabolen for 5 min på 37 ° C. Etter 15-25 slag er det nødvendig å observere intakt cellemembranen under mikroskopet og unngå brudd på mitokondrier membranen...

Mitokondrier er de viktigste cellulære organene å produsere nesten 95% av ATP brukes i pattedyrceller av oxidative fosforylering. Det er rapportert at sequestered micromolar konsentrasjonen av Ca2 + av mitokondrier, ADP, og uorganiske fosfat kan brukes til å phosphorylate ADP syntese ATP1. Når konsentrasjonen av cytosolic Ca2 + går over en viss grense, mitokondrier kan uptake Ca2 + raskt og middelklasseinnbyggere det sakte. Dermed kan fungerende mitokondrier tilstrømningen av økt cytosolic Ca2 +. Irrelevant for deltakelse i oxidative fosforylering, den mitokondrie Ca2 + også ta del i cytosolic kalsium signaler og aktivere mitokondrie apoptotisk mekanismen av inducing åpningen av mPTP i indre mitokondrie membran2. Det har vært anerkjent at unormal rettighetsutvidelse intracellulær Ca2 + kan indusere mitokondrie massiv hevelse ved å åpne mPTP3. Derfor denne protokollen skal vurdere funksjonen mitokondrie av kvantifisere mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet og Ca2 +-trigged mitokondrie hevelse.
Ca2 + oppbevaring kapasitet er måling av evnen til mitokondrier til opptak cytosolic kalsium. Mitokondrier kan bufre cytosolic gratis kalsium og regulere kalsium-avhengige mobilnettet prosesser av kalsium opptak i form av inaktive precipitates. Nedsatt Ca2 + varmekapasitet oppstår i stress fenomener forbundet med energi begrensning og selv nevrodegenerative sykdommer4,5. Isolert mitokondrier eller digitonin-permeabilized celler kan brukes til å identifisere Ca2 + oppbevaring kapasitet og forhøyet muligheten til å samle Ca2 + av isolerte mitokondrier med ytterligere glutamat og malate påvirkes ikke av de Mitokondrielt isolasjon prosedyren6. En titrerte mengde digitonin skal brukes til å permeabilize plasma membraner av forskjellige celletyper. Hexapotassium salt av Ca2 +-bindende grønne fluorescerende farge, en Ca2 +-sensitive celle-impermeant synlig lys-nervøs indikator, har vært mye brukt7. Ca2 +-bindende grønn fluorescerende fargestoff er en lav-affinitet indikator og brukes til å vise at intracellulær gratis Ca2 + konsentrasjoner fortsetter å stige under langvarig (5 min) stimulations8. Denne metoden ble mindre sensitive enn radioaktivt filter teknikken, men ble sterkt forenklet. Den ekstra Ca2 + løfter kalsium grønne fluorescens og Ca2 + opptaket av mitokondrier returnerer fluorescensen som opprinnelig plan. Sekvensielle filer av Ca2 + ble gjort til mitokondrier kunne opptak extramitochondrial Ca2 + 9. En fluorescens microplate leser kan brukes kontinuerlig rapportere kalsium grønne fluorescens.
Etter Ca2 + opphopning, mitokondrier depolarized, utgitt Ca2 + til medium, og begynte å svelle. Ca2 +-utløst mitokondrier hevelse brukes til å angi mPTP åpningen. Elektronmikroskop og nedgangen i lys absorbans ved 540 nm kan brukes til å måle Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse10,11. Mitokondrier volum kan direkte bestemmes av fremover vinkel lysspredning12, der nedgang i absorbansen gjenspeiler passiv hevelse i mitokondrie matrix.
Her vi illustrere metodikk for å undersøke mitokondrie Ca2 + oppbevaring kapasitet og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier fra SH-SY5Y celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cell line</td>
			<td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td>
			<td>ATCC Number: CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium green-5N</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>c-3737</td>
			<td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete protease inhibitors</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass homogenizer</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>9885303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES5063G-A7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46940-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>00457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan flash instruments</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IC100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bongkrekate</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>1820-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atractyloside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-glucose Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022</td>
			<td>4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11860-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NCI3225CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay

Produksjon av ATP ved oxidative fosforylering er den primære funksjonen av mitokondrier. Mitokondrier i høyere eukaryoter også delta i cytosolic Ca2 + bufring og ATP produksjonen i mitokondrie kan være formidlet av intramitochondrial gratis Ca2 + konsentrasjon. Ca2 + oppbevaring kapasitet kan betraktes som evnen til mitokondrier beholde kalsium i mitokondrie matrisen. Akkumulert intracellulær Ca2 + fører til permeabilitet av interne mitokondrie membran, kalt åpningen av mitokondrie permeabiliteten overgangen pore (mPTP), noe som fører til lekkasje av molekyler med en molekylær vekt mindre enn 1,5 kDa. Ca2 +-utløst mitokondrier hevelse brukes til å angi mPTP åpningen. Her beskriver vi to analyser for å undersøke Ca2 + varmekapasitet og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier. Etter visse mengder av Ca2 + er lagt, kan alle trinnene fullført i en dag og registrert av en microplate-leser. Dermed disse to enkle og effektive analyser kan bli vedtatt for å vurdere Ca2 +-relaterte mitokondrie funksjoner.

Representant resultatene av Ca2 + oppbevaring kapasitet: Resultatene ble uttrykt som fluorescens verdier. Med de ekstra pulser av Ca2 + (200 nmols/mg mitokondrie protein), fluorescens økte med dobbel over grunnlinjen med mPTP åpningen. 5 μM Bongkrekate (BKA), en inhibitor av Ca2 +-indusert mPTP åpning eller 1 μM atractyloside (ATR), en aktivator av Ca2 +-indusert mPTP åpning, ble lagt til i isolerte mitokondrier. Mengden totalt...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay at JoVE.com

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitokondrielt Ca2 + oppbevaring kapasitet analysen og Ca2 +-utløst mitokondrie hevelse analysen

Denne protokollen skal beskriver en metode for å undersøke Ca2 + varmekapasitet og Ca2 +- utløst mitokondrie hevelse i isolerte mitokondrier av SH-SY5Y celler trinnvis.

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Evaluering av bioenergetiske Funksjon i Cerebral vaskulære endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Analysen utvikling for høy innhold kvantifisering av Sod1 Mutant Protein samlet formasjon i levende celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysere mitokondrietransport og morfologi i humant indusert pluripotente stamcelleavledede nevroner i arvelig spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Generering av humane hjerneorganoider for mitokondriesykdomsmodellering

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Bestemmelse av mitokondrie respirasjon og glykolyse i Ex Vivo retinal vevsprøver

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

Avbildning av mitokondrie Ca2+ opptak i astrocytter og nevroner ved hjelp av genetisk kodede Ca2+ indikatorer (GECIer)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

Live-avbildning av mitokondriesystem i kultiverte astrocytter

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...