Name: mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00
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Este estudo foi suportado por concessões do subsídio do cientista proeminente de Shandong (JQ201421) e bolsa da NSFC (81371226).

1. isolamento de mitocôndrias
Nota: Todas as soluções e equipamentos devem ser pré-resfriado a 0 - 4 ° C e mantidos no gelo.
<ol><li>Semente cerca de 3 x 106 SH-SY5Y células por placa de cultura de células de 10 cm. Células de cultura em alta-glicose Dulbecco modificada do meio de águia com 10% de soro bovino fetal, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 µ g/mL). Manter a 37 ° C numa incubadora contendo 5% CO2 durante a noite. Nota: pelo menos 1-2 x 10<...

<ol>
	<li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+respiratory+stimulation,+accumulation+of+Ca+++and+phosphate,+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria.">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li><li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+transport:+mechanisms+and+functions.">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li><li>Crofts, A. R., Chappell, J. 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Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li><li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+in+neuronal+degeneration.">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. 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K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations.">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li><li>Bambrick, L. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+calcium+levels+(Rhod-2+fluorescence)+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death.">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li><li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size,+flow+cytometric+parameters,+and+ultrastructure.">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li><li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay:+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation.">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li><li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+permeability+transition+pore,+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A.">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li><li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li><li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca(2+)+transport+mechanisms.">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li></ol>

Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para o mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-disparado o ensaio de inchamento mitocondrial.
Para o isolamento mitocondrial, certifique-se de que todos os materiais e os tubos são no gelo, especialmente quando homogeneizando as células. 0,25% do trypsin-EDTA também pode ser usado para destacar células do prato por 5 min a 37 ° C. Depois de 15-25 cursos, é necessário observar a membrana celular inta...

As mitocôndrias são os principais órgãos celulares para produzir cerca de 95% do ATP usado nas células de mamíferos por fosforilação oxidativa. É relatado que o sequestrado micromolar concentração de Ca2 + pela mitocôndria, a presença de ADP e fosfato inorgânico pode ser usado para fosforilar ADP a síntese de ATP1. Quando a concentração de citosólico Ca2 + vai acima de um limite, a mitocôndria pode absorção Ca2 + rapidamente e efluxo isso lentamente. Assim, as mitocôndrias funcionamento podem influxo o aumento citosólico Ca2 +. Irrelevante para a participação na fosforilação oxidativa, o mitocondrial Ca2 + também participar os sinais de cálcio citosólico e ativar o mecanismo de apoptose mitocondrial induzindo a abertura do mPTP no interno mitocondrial membrana2. Foi amplamente reconhecido que elevação anormal de intracelular Ca2 + pode induzir edema maciça mitocondrial abrindo o mPTP3. Assim, o presente protocolo tem por objetivo avaliar a função mitocondrial através da quantificação da capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-trigged inchaço mitocondrial.
CA2 + capacidade de retenção é a medição da capacidade das mitocôndrias de cálcio citosólico de captação. As mitocôndrias podem buffer o cálcio citosólico livre e regulam processos celulares de cálcio-dependente pela absorção de cálcio na forma de precipitados inativos. Capacidade prejudicada Ca2 + retenção ocorre em fenômenos de estresse associados com limitação de energia e de4,de doenças neurodegenerativas até5. Mitocôndrias isoladas ou células digitonin-permeabilizado podem ser usadas para identificar a capacidade de Ca2 + de retenção, e a elevada capacidade de acumular Ca2 + por mitocôndrias isoladas com o glutamato additonal e malato não é efectuada pelo procedimento de isolamento mitocondrial6. Uma quantia titulada de digitonin deve ser usada para permeabilize as membranas de plasma de diferentes tipos de células. O sal de hexapotassium de Ca2 +-ligação corante fluorescente verde, uma Ca2 +-impermeant-célula visível luz-excitável indicador sensível, tem sido amplamente utilizado7. CA2 +-ligação verde tintura fluorescente é um indicador de baixa afinidade e usado para mostrar que intracelular livre Ca2 + concentrações continuarem a subir durante a prolongada de estímulos (5 min)8. Este método era menos sensível do que a técnica de filtro radioativo mas foi bastante simplificado. O adicional Ca2 + eleva a fluorescência verde do cálcio e da Ca2 + adopção pelas mitocôndrias retorna a fluorescência de base. Adições sequenciais de Ca2 + foram feitas até as mitocôndrias não conseguiram captação extramitochondrial Ca2 + 9. Um leitor de microplacas de fluorescência pode ser usado para relatar continuamente a fluorescência verde de cálcio.
Após o acúmulo de Ca2 + , mitocôndrias despolarizada, liberado Ca2 + para o meio e começaram a inchar. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Microscopia eletrônica e a diminuição da luz absorbância em 540 nm pode ser usado para medir o Ca2 +-desencadeada mitocondrial inchaço10,11. Volume de mitocôndrias pode ser diretamente determinada pelo ângulo frente espalhamento de luz12, onde diminui em absorvância reflete passivo inchaço da matriz mitocondrial.
Aqui, podemos ilustrar a metodologia para examinar a capacidade mitocondrial Ca2 + de retenção e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y de células.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cell line</td>
			<td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td>
			<td>ATCC Number: CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium green-5N</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>c-3737</td>
			<td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete protease inhibitors</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass homogenizer</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>9885303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES5063G-A7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46940-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>00457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan flash instruments</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IC100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bongkrekate</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>1820-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atractyloside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-glucose Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022</td>
			<td>4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11860-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NCI3225CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay

A produção de ATP por fosforilação oxidativa é a principal função das mitocôndrias. Mitocôndrias em eucariontes superiores também participam citosólico Ca2 + buffer, e a produção de ATP em mitocondrial pode ser mediada por intramitocondrial grátis Ca2 + concentração. Capacidade de retenção do CA2 + pode ser considerada como a capacidade das mitocôndrias de reter cálcio na matriz mitocondrial. Ca2 + pistas intracelulares acumuladas para a permeabilidade da membrana mitocondrial interna, denominado a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP), menos de 1,5 kDa de peso que leva para o escapamento de moléculas com um molecular. CA2 +-desencadeada mitocôndrias inchaço é usado para indicar a abertura do mPTP. Aqui, descrevemos dois ensaios para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial em mitocôndrias isoladas. Depois de certas quantidades de Ca2 + são adicionados, todos os passos podem ser concluídos em um dia e gravados por um leitor de microplacas. Assim, estes dois ensaios simples e eficazes podem ser adoptados para avaliar a Ca2 +-relacionado funções mitocondriais.

Resultados de representante de Ca2 + capacidade de retenção: Os resultados foram expressos em valores de fluorescência. Com os pulsos adicionais de Ca2 + (proteína mitocondrial nmols/mg 200), a fluorescência aumentada o dobro acima da linha de base com a abertura do mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), um inibidor de Ca2 +-induzida mPTP abertura, ou 1 μM atractyloside (ATR), um ativador de Ca2 +-induzida mPTP abertura, foram adiciona...

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Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

Este protocolo destina-se a descrever um método para examinar a capacidade de retenção do Ca2 + e Ca2 +- desencadeada mitocondrial inchaço das mitocôndrias isoladas de SH-SY5Y células passo a passo.

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

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