Name: mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантов Грант Грант от NSFC (81371226) и выдающийся ученый Шаньдун (JQ201421).

1. изоляция митохондрий
Примечание: Все решения и оборудование следует охладить до 0 - 4 ° C и хранится на льду.
<ol><li>Семя клетки6 SH-SY5Y около 3 x 10 на 10 см клетки культуры блюдо. Культура клетки в высоких глюкозы Дульбекко модифицированная среднего орла с 10% плода бычьим с?...

<ol>
	<li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+respiratory+stimulation,+accumulation+of+Ca+++and+phosphate,+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria.">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li><li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+transport:+mechanisms+and+functions.">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li><li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling.">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li><li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+in+neuronal+degeneration.">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+green-5N,+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2++concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons.">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li><li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations.">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li><li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons.">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling,+oxidative+cell+death,+and+reperfusion+injury.">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li><li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+calcium+levels+(Rhod-2+fluorescence)+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death.">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li><li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size,+flow+cytometric+parameters,+and+ultrastructure.">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li><li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay:+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation.">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li><li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+permeability+transition+pore,+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A.">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li><li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li><li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca(2+)+transport+mechanisms.">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li></ol>

Здесь, мы описали простой и эффективный протокол для митохондриального Ca2 + сохранение потенциала пробирного и Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек пробирного.
Для митохондриального изоляции убедитесь, что все материалы и трубы находятся на льду, особенно к...

Митохондрии являются основной сотовой органов производить почти 95% АТФ, используемые окислительного фосфорилирования в mammalian клетках. Сообщается, что поглощенных всех концентрации Ca2 + , митохондрии, присутствие ADP и неорганического фосфата может использоваться для фосфорилировать ADP синтеза АТФ1. Когда концентрация цитозольной Ca2 + идет выше порога, митохондрии можно поглощение Ca2 + быстро и измеряем его медленно. Таким образом функционирования митохондрий может приток увеличение цитозольной Ca2 +. Отношения к участию в окислительного фосфорилирования, митохондриальных Ca2 + также принимают участие в цитозольной кальция сигналов и активировать механизм митохондриальной apoptotic, вызывая открытие mPTP в внутренней митохондриальной 2мембраны. Широко признано, что аномальные повышение внутриклеточной Ca2 + может вызвать митохондриальной массивные отеки, открыв mPTP3. Таким образом, этот протокол призван оценить функцию митохондрий путем определения количественных показателей митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +-trigged митохондриальной отек.
CA2 + водоудерживающего потенциала является измерение способности митохондрий цитозольной поглощение кальция. Митохондрий может регулировать кальций зависимых клеточных процессов поглощения кальция в виде неактивных преципитаты и буфере цитозольной свободного кальция. Нарушением Ca2 + водоудерживающего потенциала происходит в стресс явления, связанные с ограничением энергии и даже нейродегенеративных заболеваний4,5. Изолированных митохондриях или digitonin-permeabilized клетки могут использоваться для идентификации Ca2 + водоудерживающего потенциала, и повышенной способностью накапливать Ca2 + , изолированных митохондриях с дополнительная глутамата и малат не осуществляется митохондриальной изоляции процедура6. Титруемая количество digitonin должен быть использован для разрушения мембран плазмы из различных типов клеток. Hexapotassium соль Ca2 +-привязка зеленого флуоресцентного красителя, Ca2 +-чувствительных клеток impermeant видимый свет возбудимых индикатор, был широко используется7. CA2 +-привязки зеленого флуоресцентного красителя является показателем низкого сродства и используется, чтобы показать, что внутриклеточные бесплатно Ca2 + концентрации продолжать расти в течение длительного (5 мин) стимуляцию8. Этот метод был менее чувствительны, чем метод радиоактивных фильтр, но была значительно упрощена. Дополнительные Ca2 + возвышает кальция Зеленая Флуоресценция и Ca2 + поглощение митохондрий возвращает флюоресценция базовой линии. Последовательных добавлений Ca2 + были сделаны до тех пор, пока митохондрии не поглощения extramitochondrial Ca2 + 9. Считыватель микропланшетов флюоресценции может использоваться непрерывно доклад кальция зеленой флуоресценцией.
После Ca2 + накопления митохондрии деполяризованный, выпущенный Ca2 + в среду и начал набухать. CA2 +-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Электронная микроскопия и уменьшение поглощения света на 540 Нм может использоваться для измерения Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек10,11. Митохондрии тома можно непосредственно определяется Форвард угол рассеяния света12, где уменьшение поглощения отражают пассивной отек митохондриальной матрицы.
Здесь, мы иллюстрируем методологии для изучения митохондриальной Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях от SH-SY5Y клеток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cell line</td>
			<td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td>
			<td>ATCC Number: CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium green-5N</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>c-3737</td>
			<td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete protease inhibitors</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass homogenizer</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>9885303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES5063G-A7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46940-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>00457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan flash instruments</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IC100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bongkrekate</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>1820-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atractyloside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-glucose Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022</td>
			<td>4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11860-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NCI3225CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay

Производства АТФ, окислительное фосфорилирование является основной функцией митохондрий. Митохондрий у высших эукариот также участвуют в цитозольной Ca2 + буферизации, и производства АТФ в митохондриальной может быть опосредовано intramitochondrial бесплатно Ca2 + концентрации. CA2 + водоудерживающего потенциала может рассматриваться как митохондрии возможность сохранить кальция в матрице митохондриальной. Накопленные внутриклеточных Ca2 + приводит к проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, назвал открытие митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP), что приводит к утечке молекул с молекулярной массой менее 1,5 кДа. CA2 +-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Здесь мы описываем двух анализов для изучения Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях. После определенного количества Ca2 + добавляются все шаги можно завершить за один день и записан Считыватель микропланшетов. Таким образом, эти два простых и эффективных анализов могут быть приняты для оценки Ca2 +-связанных митохондриальной функции.

Представитель результаты Ca2 + водоудерживающего потенциала: Результаты были высказаны как флуоресценции значения. С дополнительные импульсы Ca2 + (200 nmols/мг митохондриальных белок), увеличилось на двойной выше базовой линии с открытием mPTP флуоресценци?...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay at JoVE.com

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Митохондриальной Ca2 + сохранение потенциала пробирного и Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек Assay

Этот протокол направлен для описания метода для изучения Ca2 + водоудерживающего потенциала и Ca2 +- срабатывает митохондриальной отек изолированных митохондриях SH-SY5Y клеток, шаг за шагом.

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Визуализация Митохондриальная ДНК репликации в отдельных клетках путем усиления сигнала EDU

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Нейромодуляция и митохондриальной Транспорт: Live изображений в нейронах гиппокампа в течение длительного времени

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Определение Митохондриальная мембранного потенциала и активных форм кислорода в Живом Крыса корковых нейронов

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Оценка Биоэнергетической функции в церебральный эндотелиальных клеток сосудов

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Развитие анализа высокое содержание количественной оценки совокупных формирования Sod1 Мутантный белок в живых клетках

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Анализ митохондриального транспорта и морфологии в антропогенных плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронов в наследственной спастической параплегии

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Генерация органоидов головного мозга человека для моделирования митохондриальных заболеваний

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Определение митохондриального дыхания и гликолиза в образцах ткани сетчатки ex vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

Визуализация поглощения митохондриального Ca2+ в астроцитах и нейронах с использованием генетически закодированных индикаторов Ca2+ (GECI)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

Живая визуализация митохондриальной системы в культивируемых астроцитах

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...