Name: mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00
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Este estudio fue apoyado por subvenciones de concesión del destacado científico de Shandong (JQ201421) y concesión de NSFC (81371226).

1. aislamiento de mitocondrias
Nota: Todas las soluciones y equipos deben preenfriados a 0 - 4 ° C y mantener en hielo.
<ol><li>Semillas aproximadamente 3 x 106 SH-SY5Y células por placa de cultivo celular de 10 cm. Células en cultivo en alta glucosa Dulbecco de modificado medio de Eagle con 10% suero fetal bovino, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 μg/mL). Mantener a 37 ° C en una incubadora con 5% CO2 durante la noche. Nota: al menos 1-2 x 107 </su...

<ol>
	<li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+respiratory+stimulation,+accumulation+of+Ca+++and+phosphate,+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria.">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li><li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+transport:+mechanisms+and+functions.">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li><li>Crofts, A. R., Chappell, J. 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Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li><li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+in+neuronal+degeneration.">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. 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K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations.">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li><li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons.">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling,+oxidative+cell+death,+and+reperfusion+injury.">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li><li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+calcium+levels+(Rhod-2+fluorescence)+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death.">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li><li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size,+flow+cytometric+parameters,+and+ultrastructure.">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li><li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay:+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation.">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li><li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+permeability+transition+pore,+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A.">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li><li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li><li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca(2+)+transport+mechanisms.">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li></ol>

Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y eficaz para el mitocondrial Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa ensayo hinchazón mitocondrial.
Para el aislamiento mitocondrial, asegúrese de que todos los materiales y tubos son de hielo, especialmente cuando las células de homogeneización. 0.25% tripsina-EDTA puede utilizarse también para separar las células desde el plato durante 5 minutos a 37 ° C. Después de 15-25 golpes, es necesario observar la m...

Las mitocondrias son los principales órganos celulares que producen casi el 95% de la ATP que se utiliza en las células de mamífero por fosforilación oxidativa. Se informó que el secuestrado concentración micromolar de Ca2 + por las mitocondrias, la presencia de ADP y fosfato inorgánico puede utilizarse para fosforilan ADP síntesis ATP1. Cuando la concentración citosólica Ca2 + por encima de un umbral, las mitocondrias pueden absorción de Ca2 + rápidamente y eflujo poco a poco. Así pues, el funcionamiento de la mitocondria puede afluencia el aumento citosólico Ca2 +. Irrelevante para la participación en la fosforilación oxidativa, la mitocondrial Ca2 + también tomar parte en las señales de calcio citosólico y activar el mecanismo de apoptosis mitocondrial al inducir la apertura de la mPTP en el interior mitocondrial membrana2. Ha sido ampliamente reconocida que elevación anormal de Ca intracelular2 + puede inducir inflamación masiva mitocondrial por la apertura del mPTP3. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar la función mitocondrial mediante la cuantificación de la mitocondrial Ca2 + capacidad de la retención y Ca2 +-trigged hinchazón mitocondrial.
Capacidad de retención de CA2 + es la medida de la capacidad de las mitocondrias de calcio citosólico de absorción. Las mitocondrias pueden búfer el calcio libre citosólico y regulan procesos celulares dependientes de calcio por la absorción de calcio en forma de precipitados inactivos. Deterioro capacidad de Ca2 + retención ocurre en fenómenos de estrés asociados con limitación de energía e incluso neurodegenerativas enfermedades4,5. Permeabilized digitonin células o mitocondrias aisladas se pueden utilizar para identificar la capacidad retención de Ca2 + , y la elevada capacidad para acumular Ca2 + por mitocondrias aisladas con el glutamato adicional y malato no es afectada por la Aislamiento mitocondrial procedimiento6. Debe utilizarse una cantidad pretitulada de digitonin a permeabilizar las membranas del plasma de diferentes tipos de células. La sal de hexapotassium de Ca2 +-enlace colorante fluorescente verde, un Ca2 +-indicador excitable luz visible célula impermeant sensible, ha sido ampliamente utilizado7. CA2 +-encuadernación verde colorante fluorescente es un indicador de baja afinidad y se utiliza para mostrar que intracelular libre Ca2 + las concentraciones siguen aumentando durante prolongado (5 min) estímulos8. Este método fue menos sensible que la técnica de filtros radiactivos pero fue simplificado grandemente. El adicional Ca2 + eleva la fluorescencia verde de calcio y la absorción de Ca2 + por mitocondrias devuelve la fluorescencia a línea de fondo. Se hicieron adiciones secuenciales de Ca2 + hasta que la mitocondria no absorción extramitochondrial Ca2 + 9. Un lector de microplacas de fluorescencia puede utilizarse para informar continuamente la fluorescencia verde de calcio.
Después de la acumulación de Ca2 + , mitocondrias despolarizado, liberan Ca2 + en el medio y comenzaron a hincharse. CA2 +-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. La microscopia electrónica y la disminución ligera absorbancia a 540 nm puede usarse para medir la Ca2 +-activa de10,hinchazón mitocondrial11. Volumen de las mitocondrias puede determinarse directamente adelante ángulo dispersión ligera12, donde disminuye la absorbancia refleja inflamación pasiva de la matriz mitocondrial.
Aquí ilustramos la metodología para examinar la mitocondrial Ca2 + capacidad de la retención y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas de células SH-SY5Y.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cell line</td>
			<td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td>
			<td>ATCC Number: CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium green-5N</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>c-3737</td>
			<td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete protease inhibitors</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass homogenizer</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>9885303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES5063G-A7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46940-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>00457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan flash instruments</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IC100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bongkrekate</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>1820-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atractyloside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-glucose Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022</td>
			<td>4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11860-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NCI3225CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay

La producción de ATP por fosforilación oxidativa es la función principal de las mitocondrias. Las mitocondrias en los eucariotas superiores también participarán en citosólica Ca2 + buffering, y la producción de ATP en mitocondrial puede estar mediada por intramitochondrial gratis Ca2 + concentración. Capacidad de retención de CA2 + puede considerarse como la capacidad de las mitocondrias para retener el calcio en la matriz mitocondrial. Acumulación intracelular Ca2 + lleva a la permeabilidad de la membrana mitocondrial interna, como la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP), que conduce a la salida de moléculas con un molecular peso menos de 1.5 kDa. CA2 +-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. Aquí, Describimos dos ensayos para examinar la capacidad de retención de Ca2 + y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas. Después de ciertas cantidades de Ca2 + se ha añadido, todos los pasos pueden ser completados en un día y registrados por un lector de microplacas. Por lo tanto, pueden adoptarse estos dos análisis simples y eficaces para evaluar el Ca2 +-relacionadas con las funciones mitocondriales.

Representante resultados de capacidad de retención de Ca2 + : Los resultados se expresaron como valores de fluorescencia. Con los pulsos adicionales de Ca2 + (200 nmols/mg proteína mitocondrial), la fluorescencia aumentada por el doble por encima de la línea de fondo con la apertura del mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inhibidor de la Ca2 +-inducida por mPTP apertura o 1 μM atractyloside (ATR), un activador de la Ca2 +-inducida ...

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Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitocondrial de Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo

Este protocolo tiene por objeto describir un método para examinar la capacidad de retención de Ca2 + y Ca2 +- activa hinchazón de mitocondrias aisladas de SH-SY5Y mitocondrial de células paso a paso.

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

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