Name: mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay at JoVE.com

Denna studie stöddes av bidrag från grant av framstående vetenskapsman i Shandong (JQ201421) och bidrag från NSFC (81371226).

1. isolering av mitokondrier
Obs: Alla lösningar och utrustning bör vara förhandskyld till 0 - 4 ° C och hållas på is.
<ol><li>Utsäde ca 3 x 106 SH-SY5Y celler per 10 cm cell kultur maträtt. Kultur celler i hög-glukos Dulbecco ändrade Eagle medium med 10% fetalt bovint serum, penicillin (100 U/mL)-streptomycin (100 µg/mL). Underhåll vid 37 ° C i en inkubator som innehåller 5% CO2 över natten. Obs: minst 1-2 x 107 SH-SY5Y celler behövs för ...

<ol>
	<li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+respiratory+stimulation,+accumulation+of+Ca+++and+phosphate,+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria.">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li><li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+transport:+mechanisms+and+functions.">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li><li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling.">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li><li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+in+neuronal+degeneration.">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li><li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+green-5N,+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2++concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons.">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li><li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations.">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li><li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons.">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling,+oxidative+cell+death,+and+reperfusion+injury.">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li><li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+calcium+levels+(Rhod-2+fluorescence)+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death.">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li><li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size,+flow+cytometric+parameters,+and+ultrastructure.">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li><li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay:+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation.">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li><li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+permeability+transition+pore,+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A.">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li><li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li><li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca(2+)+transport+mechanisms.">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li></ol>

Här, vi beskrivs ett enkelt och effektivt protokoll för mitokondriell Ca2 + retention kapacitet test och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad assay.
För mitokondriell isolering, se till att alla material och rör är på is, särskilt när homogenisering cellerna. 0,25% trypsin-EDTA kan också användas för att lossa cellerna från skålen för 5 min vid 37 ° C. Efter 15-25 linjer är det nödvändigt att iaktta intakt cellmembranet under mikroskopet och undvika brot...

Mitokondrierna är de viktigaste cellulära organen att producera nästan 95% av ATP används i däggdjursceller av oxidativ fosforylering. Det rapporteras att den beslagtagna mikromolära koncentrationen av Ca2 + av mitokondrier, förekomsten av ADP och oorganiskt fosfat kan användas att fosforylera ADP till syntes ATP1. När koncentrationen av cytosoliska Ca2 + går över en tröskel, mitokondrier kan upptag Ca2 + snabbt och efflux det långsamt. Således, fungerande mitokondrier kan inflödet av ökad cytosoliska Ca2 +. Irrelevant för deltagande i den oxidativ fosforyleringen, den mitokondriella Ca2 + också delta i de cytosoliska kalcium signalerna och aktivera mitokondriell apoptotiska mekanismen genom att inducera öppnandet av mPTP i inre mitokondrie membranet2. Det har varit allmänt kända att onormal höjning av intracellulära Ca2 + kan inducera mitokondriell massiva svullnad genom att öppna den mPTP3. Detta protokoll syftar således, att bedöma mitokondriefunktion genom kvantifiera mitokondriell Ca2 + retention kapacitet och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad.
Ca2 + retention kapacitet är mätning av mitokondrier förmåga att upptag cytosoliska kalcium. Mitokondrier kan buffra de cytosoliska fritt kalciumet och reglera kalcium-beroende cellulära processer av kalcium upptag i form av inaktiva fällningar. Nedsatt Ca2 + retention kapacitet uppstår i stress fenomen förknippade med energi begränsning och även neurodegenerativa sjukdomar4,5. Isolerade mitokondrier eller digitonin-permeabilized celler kan användas för att identifiera Ca2 + retention kapacitet, och den förhöjda förmågan att ackumulera Ca2 + isolerade mitokondrien med tilläggsupplysningar glutamat och malate sker inte genom den mitokondriell isolering förfarande6. En titrerad mängd digitonin bör användas för att permeabilize plasma membran av olika celltyper. Hexapotassium salt Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne, en Ca2 +-känsliga cell-impermeant synligt ljus-retbara indikator, har varit utbredda7. Ca2 +-bindande grön fluorescerande färgämne är en indikator på låg affinitet och används för att visa att intracellulära gratis Ca2 + koncentrationer fortsätter att stiga under långvarig (5 min) stimuli8. Denna metod var mindre känslig än den radioaktiva filter tekniken men var kraftigt förenklad. Den ytterligare Ca2 + höjer kalcium grön fluorescens och Ca2 + upptaget av mitokondrier returnerar fluorescensen till baslinjen. Sekventiell tillägg av Ca2 + gjordes tills mitokondrierna underlåtit att upptag extramitochondrial Ca2 + 9. En fluorescens microplate reader kan användas kontinuerligt rapportera kalcium gröna fluorescensen.
Efter Ca2 + ackumulation, mitokondrierna Aricebo släppt Ca2 + till medium och började svälla. Ca2 +-utlöst mitokondrier svullnad används för att indikera mPTP öppningen. Elektronmikroskopi och minskningen av ljusabsorbans vid 540 nm kan användas för att mäta den Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad10,11. Mitokondrier volym kan bestämmas direkt genom framåt vinkel ljusspridning12, där minskningar av absorbansen återspeglar passiva svullnad av mitokondriell matrisen.
Här, vi illustrera metoden för att undersöka mitokondriell Ca2 + retention kapacitet och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad i isolerade mitokondrier från SH-SY5Y celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y cell line</td>
			<td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td>
			<td>ATCC Number: CRL-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium green-5N</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>c-3737</td>
			<td>Ca2+-binding green fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>complete protease inhibitors</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass homogenizer</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>9885303002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES5063G-A7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46940-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>00457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan flash instruments</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IC100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bongkrekate</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>1820-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atractyloside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-glucose Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022</td>
			<td>4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11860-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NCI3225CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>704001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondrial ca2+ retention capacity assay and ca2+-triggered mitochondrial swelling assay

Produktionen av ATP genom oxidativ fosforylering är den primära funktionen av mitokondrier. Mitokondrier i högre eukaryotes också delta i cytosoliskt Ca2 + buffring och ATP produktionen i mitokondriell kan medlas av intramitochondrial gratis Ca2 + koncentration. Ca2 + retention kapacitet kan betraktas som förmåga att mitokondrierna att behålla kalcium i matrisen mitokondrie. Ackumulerade intracellulära Ca2 + leder till permeabiliteten i det inre mitokondriella membranet, kallas öppnandet av mitokondriell permeabilitet övergången pore (mPTP), vilket leder till läckage av molekyler med en molekylär vikt mindre än 1,5 kDa. Ca2 +-utlöst mitokondrier svullnad används för att indikera mPTP öppningen. Här beskriver vi två analyser för att undersöka Ca2 + retention kapacitet och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad i isolerade mitokondrier. Efter vissa mängder av Ca2 + läggs, kan alla steg vara klar på en dag och inspelad av en microplate reader. Således dessa två enkla och effektiva testmetoder kan antas för att bedöma den Ca2 +-mitokondriella funktioner.

Representativa resultat av Ca2 + Retention kapacitet: Resultaten uttrycktes som fluorescens värden. Med ytterligare pulser av Ca2 + (200 nmols/mg mitokondriell protein), fluorescensen ökade med dubbel över baslinjen med mPTP öppningen. 5 μM Bongkrekate (BKA), en hämmare av Ca2 +-inducerad mPTP öppning, eller 1 μM atractyloside (ATR), en aktivator av Ca2 +-inducerad mPTP öppning, lades i isolerade mitokondrier. Mängden total...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay at JoVE.com

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitokondriell Ca2 + Retention kapacitet Assay och Ca2 +-utlöst mitokondriell svullnad Assay

Detta protokoll syftar till att beskriva en metod för att undersöka Ca2 + retention kapacitet och Ca2 +- utlöst mitokondriell svullnad av isolerade mitokondrier av SH-SY5Y celler steg för steg.

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Visualisering av mitokondrie-DNA replikering i enskilda celler med Edu signalförstärkning

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulering och mitokondriell Transport: Bildproduktion i hippocampus nervceller under långa löptider

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Fastställande av mitokondriell membranpotential och reaktiva syreradikaler i Live Rat kortikala Neuroner

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Utvärdering av bioenergetisk Funktion i Cerebral vaskulära endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Assay utveckling för hög innehåll kvantifiering av Sod1 Mutant Protein sammanlagda bildandet i levande celler

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Analysera mitokondriell transport och morfologi i mänskliga inducerad pluripotent stamcell-härledda nervceller i ärftliga spastisk paraplegi

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Generation av mänskliga hjärnorganoider för mitokondriell sjukdom modellering

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Bestämning av mitokondriell andning och glykolys i ex vivo retinal vävnadsprover

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

Imaging mitokondriell Ca2+ upptag i astrocyter och nervceller med genetiskt kodade Ca2+ indikatorer (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

Live-avbildning av mitokondriellt system i odlade astrocyter

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...