Name: visualization and live imaging of oligodendrocyte organelles in organotypic brain slices using adeno-associated virus and confocal microscopy
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy at JoVE.com

Wir danken Linda Hildegard Bergersen und Magnar Bjørås für den Zugang zu Handy-Lab und Ausrüstung, Janelia Molekularbiologie gemeinsame Ressource Personal für Plasmid und Virus-Produktion und Koen Vervaeke Unterstützung bei Lasermessungen macht. Diese Arbeit wurde von der norwegischen Health Association, der Norwegische Forschungsrat finanziert und die Mikroskopie-Ausrüstung wurde durch Norbrain finanziert.

die hier beschriebenen Vorgänge von der norwegischen Tier Forschung Behörde genehmigt worden. Lieferanten und Bestellnummern für das Verbrauchsmaterial und andere erforderliche Ausrüstung gibt es in der Liste der Materialien am Ende des Dokuments.
 1. Vorbereitung des organotypischen Scheiben Hinweis: dieses Rezept nutzt zwei Maus-Welpen bei postnatalen Tag 7-9 (p7-9), die Ausbeute 24 organotypischen Scheiben aufgeteilt auf zwei sechs-Well Kultur Gerichte. Sofer...

<ol>
	<li>Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+organization+of+oligodendrocyte+processes+during+development+in+culture+and+in+vivo.">Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo.</a> Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).</li><li>Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+distribution+of+endoplasmic+reticulum+proteins+and+mitochondria+at+specialized+Ca2++release+sites+in+oligodendrocyte+processes.">High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes.</a> J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).</li><li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo.">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy.">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).</li><li>Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+imaging+of+myelin+degradation+reveals+a+calcium-dependent+pathway+in+lyso-PtdCho-induced+demyelination.">Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination.</a> J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nat. Med. 20, 443-449 (2014).</li><li>Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+viral+vector+production+and+purification.">Recombinant adeno-associated viral vector production and purification.</a> Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide-directed+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).</li><li>Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+gene+contains+separate+enhancers+for+oligodendrocyte+and+Schwann+cell+expression.">Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression.</a> J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).</li><li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+and+structure+of+mitochondria+in+oligodendrocytes+and+their+myelin+sheaths.">Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths.</a> Glia. 64, 810-825 (2016).</li><li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons.">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li><li>Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).</li><li>Macaskill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses.">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li><li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage.">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).</li><li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oligodendrocyte+development+and+myelination+by+glucose+and+lactate.">Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate.</a> J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).</li><li>Davison, A. N., Dobbing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+as+a+vulnerable+period+in+brain+development.">Myelination as a vulnerable period in brain development.</a> Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+neuronal+degeneration+in+organotypic+slice+cultures.">Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures.</a> Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Pignataro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Viral+Vectors+Serotype+8+for+Cell-Specific+Delivery+of+Therapeutic+Genes+in+the+Central+Nervous+System.">Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System.</a> Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).</li><li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+tract+transduction:+a+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector.">Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Ther. 19, 49-60 (2012).</li><li>Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+composition+of+molecular+motors+on+moving+axonal+cargo+using+cargo+mapping+analysis.">Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis.</a> J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).</li></ol>

Das Protokoll zur Herstellung von organotypischen Kulturen hier beschrieben ist eine modifizierte Version18 des Protokolls von De Simoni und Yu (2006)5beschrieben. Die wichtigsten Änderungen sind nachfolgend dargelegt worden. TRIS-Puffer ist das Kulturmedium hinzugefügt, die das Überleben der Scheiben wenn außerhalb des Inkubators während virale Transduktion und Wechsel des Mediums Zelle verbessert. Die Sterilisation für Konfetti wird ebenfalls geändert. Während and...

Weißen Substanz des Gehirns besteht aus Nervenzellen Axone eingewickelt in Myelin, eine spezielle erweiterte Plasmamembran von Oligodendrozyten gebildet. Myelin ist für schnelle und zuverlässige Aktionspotential Ausbreitung und langfristiges Überleben der Markhaltige Axone erforderlich, und ein Verlust von Myelin kann neurologische Dysfunktion verursachen. Trotz ihrer großen Bedeutung sind die Eigenschaften von Oligodendrozyten weniger bekannte Neuronen und Astrozyten im Vergleich. Infolgedessen wurden weniger Werkzeuge für das Studium von Oligodendrozyten entwickelt.
Leben Sie Bildgebung von Zellorganellen, wie Mitochondrien, endoplasmatischen Retikulum (ER) oder verschiedene vesikuläre Strukturen, dynamische Veränderungen in der Organellen im Laufe der Zeit zu studieren nützlich sein können. Traditionell wurde Bildgebung der lebenden Oligodendrozyten in Monokulturen1,2durchgeführt. Jedoch Oligodendrozyten in Monokultur zeigen keine kompakte Myelin und organotypischen oder akuten Hirnschnitten, daher möglicherweise eine bessere Option bei der Lokalisierung und Bewegung der Organellen zu studieren. Lokalisierung von kleine Organellen und Proteinen in der Myelinscheide kann aufgrund der kurzen Entfernung zwischen Markhaltige Axon und die umgebenden Myelinscheide schwierig sein. So haben leichte mikroskopische Immunostaining Verfahren allein nicht die räumliche Auflösung zur Unterscheidung zwischen Organellen in der Myelinscheide und diejenigen in Markhaltige Axon. Dies kann durch virale Transduktion mit Genen für Organelle ausgerichtete fluoreszierende Proteine angetrieben von Zelle typspezifische Promotoren gelöst werden. Die Vorteile sind ein zellspezifische und spärlich Ausdruck, der genaue Beurteilung der Organelle Lokalisierung und Dynamik ermöglicht. Transgene Tiere können auch verwendet werden, um solch eine Organelle ausgerichtete zellspezifische Ausdruck3zu erreichen. Jedoch die Herstellung und Instandhaltung von transgenen Tieren ist teuer und bieten in der Regel nicht die spärlichen Ausdruck, der durch virale Methoden erreicht werden kann.
Die beschriebene Methode verwendet hier virale Transduktion von Oligodendrozyten mit mitochondrialen gezielt fluoreszierenden Proteinen (Dsred oder grün fluoreszierenden Proteins, GFP) angetrieben von Myelin basic Protein Promotor (MBP-Mito-Dsred oder MBP-Mito-GFP) zu visualisieren Oligodendrozyt Mitochondrien in organotypischen Hirnschnitten. Darüber hinaus wird Ausdruck einer anderen fluoreszierenden Proteins im Zytoplasma (GLP zusammen mit Mito-Dsred oder Tdtomato mit Mito-GFP verwendet) zur Visualisierung der Zellmorphologie, einschließlich der zytoplasmatischen Kompartimente der Myelinscheide ermöglichen. Das Protokoll enthält die Verfahren zur Herstellung von organotypischen Gehirnscheiben (eine modifizierte Version des Protokolls von De Simoni und Yu, 20064,5beschrieben). Dann beschreiben wir die Time-Lapse bildgebende Verfahren zur Untersuchung der mitochondrialen Bewegung. Dieses Verfahren nutzt eine aufrechte confocal Mikroskop mit einem kontinuierlichen Austausch von bildgebendes Medium, eine Einrichtung, die einfache Anwendung von Drogen oder anderen mittleren Änderungen während der Bildgebung ermöglicht. Die Time-Lapse bildgebende Verfahren kann auf jedem confocal Mikroskop mit einige zusätzliche Ausrüstung für die Aufrechterhaltung der lebenden Scheiben wie unten beschrieben durchgeführt werden. Das Protokoll enthält auch einige Tipps zur Optimierung der Bildgebung und Reduzierung Phototoxizität.
Zu guter Letzt bezeichnet man eine schnelle und einfache Möglichkeit, ungefärbten Myelin durch Reflexion der konfokalen Mikroskopie (CoRe) zu visualisieren. Dies ist nützlich, um die Myelinscheide während der live-Aufnahme zu identifizieren. In den letzten Jahren verschiedene Techniken wurden entwickelt um Bild Myelin ohne jede Färbung erforderlich, aber die meisten von Ihnen erfordern spezifische Ausstattung und Kompetenz6,7,8. Das hier beschriebene Verfahren verwendet die Reflexionseigenschaften der Myelinscheide und ist eine vereinfachte Single-Erregung Wellenlänge Version der spektrale Reflexion der konfokalen Mikroskopie (Partitur, in denen mehrere-Wellenlängen Laser werden kombiniert, um Myelin zu visualisieren) 9. Kern kann auf jede confocal Mikroskop, das 488 nm Laser und ein 470-500 nm Emission Bandpassfilter oder einen einstellbaren Emission Filter erfolgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A9539</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:167px;">BD Microlance 19G</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:125px;">301500</td>
			<td style="width:171px;">Needles used for in- and outlet of bath</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:167px;">Bioxide gas</td>
			<td style="width:139px;">AGA</td>
			<td style="width:125px;">105701</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:167px;">Brand pipette bulbs</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">Z615927</td>
			<td style="width:171px;">Pipette bulbs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:167px;">Bunsen burner (Liquid propane burner)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">89038-530</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:167px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">64-0106&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Temperature controller - thermometer part</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">CaCl2</td>
			<td style="width:139px;">Fluka</td>
			<td style="width:125px;">21100</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:167px;">CO2&#160;</td>
			<td style="width:139px;">AGA</td>
			<td style="width:125px;">100309</td>
			<td style="width:171px;">CO2 for incubator</td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:167px;">Cover glass, square Corning</td>
			<td style="width:139px;">Thermo&#160; Fischer Scientific</td>
			<td style="width:125px;">13206778</td>
			<td style="width:171px;">To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G7021</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Delicate forceps</td>
			<td style="width:139px;">Finescience</td>
			<td style="width:125px;">11063-07</td>
			<td style="width:171px;">For dissection</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:167px;">Diamond scriber pen</td>
			<td style="width:139px;">Ted Pella Inc.</td>
			<td style="width:125px;">54463</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:167px;">Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">612-1702</td>
			<td style="width:171px;">Glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Double edge stainless steel razor blade</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">#7200</td>
			<td style="width:171px;">Razor blade for vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:167px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">24010-043</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Filter paper circles</td>
			<td style="width:139px;">Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td style="width:125px;">300,220</td>
			<td style="width:171px;">Filter paper used for filtration of PFA</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Fun tack</td>
			<td style="width:139px;">Loctite</td>
			<td style="width:125px;">1270884</td>
			<td style="width:171px;">Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Hand towel C-Fold 2</td>
			<td style="width:139px;">Katrin</td>
			<td style="width:125px;">344388</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:167px;">Harp, Flat for RC-41 Chamber,</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">&#160;64-1418</td>
			<td style="width:171px;">Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:167px;">HEPES, FW: 260.3</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H-7006</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:167px;">Holten LaminAir, Model 1.2</td>
			<td style="width:139px;">Heto-Holten</td>
			<td style="width:125px;">96004000M</td>
			<td style="width:171px;">Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:167px;">Horse serum, heat inactivated</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">26050-088</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">KCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P9541</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:167px;">LCR Membrane, PTFE,&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">FHLC0130</td>
			<td style="width:171px;">Confetti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">Leica VT1200</td>
			<td style="width:139px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;">14048142065</td>
			<td style="width:171px;">Vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">MEM-Glutamax with HEPES</td>
			<td style="width:139px;">Thermo&#160; Fischer Scientific</td>
			<td style="width:125px;">42360024</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:167px;">MgCl2</td>
			<td style="width:139px;">R.P. Normapur</td>
			<td style="width:125px;">25 108.295</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Micro Spoon Heyman Type B</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">62411-B</td>
			<td style="width:171px;">Small, rounded spatula with sharpened end for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Millex-GP filter unit</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">SLGPM33RA</td>
			<td style="width:171px;">Syringe filter unit</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:167px;">Millicell cell culture insert, 30 mm</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">PICM03050</td>
			<td style="width:171px;">Cell culture inserts</td>
		</tr>
		<tr height="90">
			<td height="90" style="height:90px;width:167px;">Minipuls 3 Speed Control Module</td>
			<td style="width:139px;">GILSON</td>
			<td style="width:125px;">F155001</td>
			<td style="width:171px;">Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:167px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S7907</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:167px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S9888</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:167px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S8282</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:139px;">Fluka</td>
			<td style="width:125px;">71628</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:167px;">Nunclon Delta Surface</td>
			<td style="width:139px;">Thermo&#160; Fischer Scientific</td>
			<td style="width:125px;">140675</td>
			<td style="width:171px;">Culture plate</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:167px;">Nystatin Suspension</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">N1638</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:93px;width:167px;">Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 40x/1.0 DIC&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Zeiss</td>
			<td style="width:125px;">441452-9900-000&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Parafilm</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">291-1211</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Paraformaldehyde, granular</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">#19208</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:167px;">PC-R perfusion chamber</td>
			<td style="width:139px;">SiSkiYou</td>
			<td style="width:125px;">&#160;15280000E</td>
			<td style="width:171px;">Bath for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:167px;">Penicillin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">15070-063</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Petri dish 140 mm&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Heger</td>
			<td style="width:125px;">1075</td>
			<td style="width:171px;">Large Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:167px;">Petri dish 92x16 mm&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sarstedt&#160;</td>
			<td style="width:125px;">82.1473</td>
			<td style="width:171px;">Medium Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">Petridish 55x14,2 mm</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">391-0868</td>
			<td style="width:171px;">Small Petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:167px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4417</td>
			<td style="width:171px;">PBS tablets</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">R2 Two Channel Head&#160;</td>
			<td style="width:139px;">GILSON</td>
			<td style="width:125px;">F117800</td>
			<td style="width:171px;">Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:167px;">Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">82027-528</td>
			<td style="width:171px;">Large spatula for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Sand paper</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">MMMA63119</td>
			<td style="width:171px;">Optional, for smoothing broken glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Scissors,&#160; 17,5 cm</td>
			<td style="width:139px;">Finescience</td>
			<td style="width:125px;">14130-17</td>
			<td style="width:171px;">Large scissors for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Scissors, 8,5&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Finescience</td>
			<td style="width:125px;">14084-08</td>
			<td style="width:171px;">Small, sharp scissors for&#160; dissection</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Single edge, gem blade</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">#71972</td>
			<td style="width:171px;">Single edge razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:167px;">Single inline solution heater SH-27B</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">64-0102</td>
			<td style="width:171px;">Temperature controller - heater part</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:167px;">Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:171px;">Filter to sterilize solutions</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:167px;">Super glue precision</td>
			<td style="width:139px;">Loctite</td>
			<td style="width:125px;">1577386</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:167px;">Surgical scalpel blade no. 22</td>
			<td style="width:139px;">Swann Morton Ltd.</td>
			<td style="width:125px;">209</td>
			<td style="width:171px;">Rounded scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:167px;">Temperature controller TC324B</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">64-0100</td>
			<td style="width:171px;">Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:167px;">Trizma base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:125px;">T1503</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">Trizma HCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">T3253</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:167px;">Water jacketed incubator series II</td>
			<td style="width:139px;">Forma Scientific</td>
			<td style="width:125px;">78653-2882</td>
			<td style="width:171px;">Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and live imaging of oligodendrocyte organelles in organotypic brain slices using adeno-associated virus and confocal microscopy

Nervenzellen setzen auf die elektrische Isolierung und trophischen Unterstützung der Myelinating Oligodendrozyten. Trotz der Bedeutung der Oligodendrozyten wurden die erweiterte Tools derzeit verwendet, um Neuronen, studieren nur teilweise getroffen auf Oligodendrozyt Forscher. Zelle typspezifische Färbung durch virale Transduktion ist ein sinnvoller Ansatz, live Organelle Dynamik zu studieren. Dieser Beitrag beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung von Oligodendrozyt Mitochondrien in organotypischen Gehirnscheiben durch Transduktion mit Adeno-assoziierte Virus (AAV) mit Genen für mitochondriale gezielte fluoreszierende Proteine von transkriptionelle kontrolliert Das Myelin basic Protein Förderer. Freuen Sie sich auf das Protokoll zur Herstellung von organotypischen koronalen Maus Gehirnscheiben. Ein Verfahren für Zeitraffer-Aufnahmen von Mitochondrien dann folgt. Diese Methoden auf andere Organellen übertragen werden können und möglicherweise besonders hilfreich für das Studium Organellen in der Myelinscheide. Schließlich beschreiben wir eine leicht verfügbare Technik zur Visualisierung von ungefärbten Myelin in lebenden Scheiben durch Reflexion der konfokalen Mikroskopie (CoRe). Kern erfordert keine zusätzliche Ausrüstung und kann nützlich sein, um die Myelinscheide während der live-Aufnahme zu identifizieren.

Organotypischen Gehirnscheiben, die kultiviert und ausgestrahlt, wie oben beschrieben wurden, zeigte eine spärliche Verteilung der kortikalen Oligodendrozyten mit dem Ausdruck Mito_dsred und GLP. Immunostaining mit Antikörpern gegen Olig2 und MBP bestätigte, dass der Ausdruck spezifisch für Oligodendrozyten (Abbildung 1).
Für live Aufnahmen wurden ausgestrahlt Oligodendrozyten durch ihre charak...

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Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Myelinating Oligodendrozyten fördern schnelle Aktionspotential Ausbreitung und neuronale überleben. Hier beschriebene ist ein Protokoll für Oligodendrozyt-spezifischen Ausdruck der fluoreszierende Proteine in organotypischen Gehirnscheiben mit nachfolgenden Zeitraffer Bildgebung. Darüber hinaus wird ein einfaches Verfahren zur Visualisierung von ungefärbten Myelin vorgestellt.

Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Forschung

Neurowissenschaften

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselektive Biolistic Targeting in Organotypische Hirnschnitten mit modifizierter Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Bildgebung von intrazellulärem ATP in organotypischen Gewebescheiben des Maushirns mit dem FRET-basierten Sensor ATeam1.03YEMK

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...