Name: sample preparation for endopeptidomic analysis in human cerebrospinal fluid
Uploaded: 2017-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid at JoVE.com

תודות Tanveer Batth ועמיתיו לקבלת ייעוץ בנושא קביעת שיטת fractionation מראש.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון של המועצה למחקר השבדי, את Wallström ואת Sjöblom קרן, את האקדח, ברטיל Stohne קרן Stiftelse, קרן Bergwall מגנוס, קרן Åhlén, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen לפרטים שלך Tjänarinnor גמלא, קנוט, אליס ולנברג קרן, Frimurarestiftelsen ו ג ינג-Västra Götalandsregionen.
הנמענים העיקרי של המימון לפרויקט זה היו מנהלים Blennow, הנריק Zetterberg, יוהן Gobom.

פרוטוקול המתואר להלן הוא גרסה מעודנת של שימוש במחקר הקודם שבו כמות גדולה של פפטידים אנדוגני אותרו ב- CSF האנושי15. עדכונים הפרוטוקול המקורי לערב שינוי קטן לטיפול כימי קדם CSF, כמו גם אופטימיזציה של המילוי ההדרגתי המשמש עבור fractionation קדם RP HPLC גבוהה pH במצב לא מקוון.
<stron...

<ol>
	<li>Wimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+worldwide+costs+of+dementia+2015+and+comparisons+with+2010.">The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010.</a> Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).</li><li>Scheltens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).</li><li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer's+disease:+the+IWG-2+criteria.">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li><li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer's+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).</li><li>Spellman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+multiplexed+mass+spectrometry+based+assay+for+measuring+candidate+peptide+biomarkers+in+Alzheimer's+Disease+Neuroimaging+Initiative+(ADNI)+CSF.">Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).</li><li>H&#246;glund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease&#8212;Recent+biomarker+developments+in+relation+to+updated+diagnostic+criteria.">Alzheimer's disease&#8212;Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria.</a> Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).</li><li>Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+repertoire+of+human+cerebrospinal+fluid:+novel+proteolytic+fragments+of+neuroendocrine+proteins.">Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).</li><li>Yuan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebrospinal+fluid+peptidomics.">Human cerebrospinal fluid peptidomics.</a> J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).</li><li>Berven, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+influence+on+the+low+molecular+weight+cerebrospinal+fluid+proteome.">Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome.</a> Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).</li><li>Zougman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+the+cerebrospinal+fluid+peptidome+and+proteome.">Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome.</a> J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).</li><li>Holtta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidome+analysis+of+cerebrospinal+fluid+by+LC-MALDI+MS.">Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS.</a> PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).</li><li>Holtta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+workflow+for+multiplex+CSF+proteomics+and+peptidomics-identification+of+candidate+cerebrospinal+fluid+biomarkers+of+Alzheimer's+disease.">An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).</li><li>Hansson, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+cerebrospinal+fluid+endopeptidome.">Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome.</a> Proteomics. 17 (5), (2017).</li><li>Guldbrandsen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+characterization+of+the+cerebrospinal+fluid+(CSF)+proteome+displayed+through+the+CSF+proteome+resource+(CSF-PR).">In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR).</a> Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).</li><li>Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+human+cerebrospinal+fluid:+discovery+and+verification+of+biomarker+candidates+in+neurodegenerative+diseases+using+quantitative+proteomics.">Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics.</a> J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).</li><li>H&#246;ltt&#228;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+the+&#947;-secretase+inhibitor+semagacestat+alters+the+cerebrospinal+fluid+peptidome+in+humans.">A single dose of the &#947;-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans.</a> Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).</li><li>Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Comparison+of+Fractionation+Methods+for+In-depth+Analysis+of+Plasma+Proteomes.">Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes.</a> J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).</li><li>Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+peptide+fractionation+strategies+used+in+proteome+analysis.">Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis.</a> J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).</li><li>Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonality+of+separation+in+two-dimensional+liquid+chromatography.">Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+the+effect+of+urea+and+guanidinium+chloride+on+the+dynamics+of+unfolded+polypeptide+chains.">Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains.</a> J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).</li><li>Ho&#776;ltta&#776;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+Workflow+for+Multiplex+CSF+Proteomics+and+Peptidomics+Identification+of+Candidate+Cerebrospinal+Fluid+Biomarkers+of+Alzheimer&#8217;s+Disease.">An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer&#8217;s Disease.</a> J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).</li></ol>

המבוא של גבוהה pH RP HPLC fractionation שלפני שלב לפרוטוקול בעבר מפותח עבור שחזור של פפטידים אנדוגני לפי משקל מולקולרי אולטראפילטרציה11 מדגם היחסי מורכבות מופחתת, ובכך למעשה איפשר עבור גדול 5 פי נפח דגימה שילמדו. זה, בתורו, גדל הריכוז של המשנה של פפטידים נוכח כל שבר, ובכך לשפר את הסיכויים ?...

סמנים ביולוגיים בנוזל מוחי שדרתי (CSF) הם בחקר כעת לתוך הפרעות ניווניות. של מחלת האלצהיימר, הפרעה ניווניות הנפוץ ביותר, משפיע על מעל ל-60 מיליון אנשים ברחבי העולם1,2, שלישיה סמן המורכב של פפטיד בטא עמילואיד, ייצוב ליבות microtubule חלבון טאו, ו- a phosphorylated טאו טופס, ניתן לזהות את המחלה עם רגישות גבוהה, כבר נכלל קריטריונים אבחון מחקר3. מחלות ניווניות אחרות, כגון מחלת פרקינסון, טרשת נפוצה, פרוטיאומיה מבנית מחקרים זיהו סמן מועמדים רבים, שחלקם נמצאים כעת תחת הערכה מחקרים קליניים4,5 ,6.
לצד חלבונים, CSF מכיל גם שפע של פפטידים אנדוגני7,8,9,10,11,12. המהוות מוצרים המחשוף של חלבונים רבים נגזר המוח, פפטידים אלה מייצגים גם מקור פוטנציאלי חשוב של סמנים למחלת. כדי להגדיל את המלאי של פפטידים אנדוגני מזוהה ב- CSF אנושי ולאפשר CSF ניתוחים endopeptidomic במחקרים קליניים, פותחה שיטה עבור הכנת הדוגמא וניתוח LC-MS (ערכה פרוטוקול קצר כבר נכלל באיור 1 ). היישום של שיטה זו של מחקר שנערך לאחרונה הביא הזיהוי של פפטידים CSF אנדוגני כמעט 16,400 במאגר דגימות נוזל מוחי-שדרתי מאנשים שונים שאינם ספציפיים אבחון, מרחיבה endopeptidome CSF ידוע ten-fold13. השיטה לחלופין ניתן בשילוב עם הגישה isobaric תוויות על כימות.
הכנת הדוגמא
המקור העיקרי של מסת חלבון ב- CSF הוא המרכיבים פלזמה (למשל אלבומין ו- immunoglobulins) שהעביר את הדם במוח מכשול14,15. שפע גבוהה שלהם הסלים זיהוי הדגימה נמוך-בשפע, המוח-derived רכיבים. פפטידים אנדוגני ניתן להפריד בקלות מן החלבונים גבוהה-בשפע, ובכך לאפשר נפח גדול יותר באופן משמעותי של CSF תמצית פפטיד שישמש עבור ניתוח LC-MS, ובכך מאפשר זיהוי של פפטידים התחתונה-בשפע.
פרוטוקול המובאת כאן, משקל מולקולרי סינון ניתוק (MWCO) שימשה להפריד את פפטידים CSF השבר חלבון; שיטה בה נעשה שימוש בכמה הקודם מחקרים8,9,10,11,12,16. השלב הסינון בעקבות שלב טרום fractionation RP HPLC מנותק לבצע מעבר הדרגתי שלב ניידות גבוהה pH. על ידי ביצוע שני צעדים RP HPLC, במשולב עם pH להיות ההבחנה העיקרית, ההבדל סלקטיביות בין שני השלבים נובעת בעיקר השמירה פפטיד שינו בעקבות הברית תשלום פפטיד שונים. היישום של פפטיד גבוהה pH fractionation מראש לפני LC-MS בתנאים חומציים הוכח יעיל בהגדלת פפטיד זיהוי17,18, ולהיות אפילו מעולה למטרה זו בביולוגיים מורכבים לעומת יותר ההפרדה אורתוגונלית מצבי19, כגון חתול חזק-ion exchange (SCX) ו- RP20דוגמאות. כדי לקצר את זמן הניתוח, שימש ערכת שרשור, צירוף כל 12th שבר (למשל, שברים 1, 13, 25, 37 ו- 49), אשר בשל הכוח פתרון גבוהה של RP HPLC עדיין במידה רבה להימנע שיתוף • תנאי של פפטידים מ שונה שברים ב- LC-MS שלב20,21.
זיהוי פפטיד
זיהוי פפטיד במחקרים peptidomic שונה מזו של מחקרים פרוטיאומיה מבנית בכך בלי מחשוף אנזים ניתן לציין את חיפוש מסד הנתונים, כתוצאה מכך, זיהוי המחירים הם בדרך כלל נמוך11. מחקר האחרונות13 הראה כי ביותר במחירים זיהוי פפטידים אנדוגני שהושג עם Sequest, הקמע שופרו באופן משמעותי כאשר ברירת המחדל הבקיע אלגוריתם של התוכנה המתאימים שונתה באמצעות החריצים מסתגלת אלגוריתם תאמינו, המציין כי אלגוריתמים הבקיע אופטימלית אנדוגני פפטידים שונים של פפטידים tryptic13. באותו מחקר, זיהוי מבוסס על רצף דה נובו פפטיד אוטומטית באמצעות תוכנה פסגות (BSI) נמצאה להיות משלים מנועי חיפוש מבוססי טביעת אצבע של יון קטע שני, וכתוצאה מכך ערכה גדול יותר באופן משמעותי של מזוהה פפטידים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1564">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:547px;">&#160;1 M Triethylammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:339px;">Fluka, Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:339px;">17902-100ML</td>
			<td style="width:339px;">TEAB</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">&#160;8 M Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7294-100ML</td>
			<td>GdnHCl</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:547px;">Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>20490</td>
			<td>TCEP</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Iodoacetamide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td>IAA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Hydroxylamine 50% (w/w)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>457804-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-2L</td>
			<td>AcN</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Formic acid</td>
			<td>Fluka, Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>56302-1mL-F</td>
			<td>FA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Triflouroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-10AMP</td>
			<td>TFA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>30501-1L-1M</td>
			<td>NH4OH</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td>MWCO-filter</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Sep-Pak C18, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT023590</td>
			<td>SPE-column</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Resprep 12-port SPE Manifold&#160;</td>
			<td>Restek</td>
			<td>26077</td>
			<td>Vacuum manifold</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">TMT10plex Isobaric Label Reagent Set</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90110</td>
			<td>TMT10plex</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">UltiMate 3000 RSLCnano LC System</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>5200.0356</td>
			<td>Online sample separation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBEZ</td>
			<td>Offline high-pH fractionation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:339px;">IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Mass spectrometer for sample analysis</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Proteome Discoverer 2.0&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGABSFAKJMAUH</td>
			<td>Proteomics search platform</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Mascot v2.4</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td style="width:339px;">&#160;-&#160;</td>
			<td>Proteomics search engine</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Sequest HT</td>
			<td>Thermo</td>
			<td style="width:339px;">&#160;-&#160;</td>
			<td>Proteomics search engine</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">PEAKS v7.5&#160;</td>
			<td>Bioinformatic Solutions Inc.)</td>
			<td style="width:339px;">&#160;-&#160;</td>
			<td>Proteomics search engine</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Acclaim PepMap 100, 75 &#181;m x 2 cm, C18, 100 &#197; pore size, 3 &#181;m particle size</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td>Trap column (nano HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Acclaim PepMap C18, 75 &#181;m x 500 mm, 100&#197; pore size,&#160;2 &#181;m particle size</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>164942</td>
			<td>Separation Column (nano HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Savant SpeedVac High Capacity Concentrators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SC210A-230</td>
			<td>SpeedVac/Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">XBridge Peptide BEH C18 Column, 130&#197;, 3.5 &#181;m, 2.1 mm X 250 mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003566</td>
			<td>Separation Column (micro HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for endopeptidomic analysis in human cerebrospinal fluid

פרוטוקול זה מתאר שיטה שפותחה כדי לזהות פפטידים אנדוגני האנושי נוזל מוחי שדרתי (CSF). למטרה זו, שיטה שפותחה בעבר מבוסס על סינון ניתוק (MWCO) משקל מולקולרי, ניתוח spectrometric המוני היה בשילוב עם שלב טרום fractionation HPLC מנותק גבוהה pH שלב הפוכה.
הפרשת לתוך CSF הוא השביל הראשי הסרה של מולקולות לשפוך על ידי תאים של מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, תהליכים רבים במערכת העצבים המרכזית משתקפים CSF, טיוח זה נוזל אבחון יקר. CSF יש קומפוזיציה מורכב, המכיל חלבונים המתפרסים על פני טווח הריכוז של 8-9 סדרי גודל. מלבד חלבונים, מחקרים קודמים הדגימו גם הנוכחות של מספר גדול של פפטידים אנדוגני. בעוד פחות בהרחבה למד מאשר חלבונים, אלה בחובו גם עניין פוטנציאלי כמו סמנים ביולוגיים.
פפטידים אנדוגני הופרדו מן התוכן חלבון נוזל מוחי-שדרתי דרך סינון MWCO. על-ידי הסרת רוב תכולת החלבון של המדגם, זה אפשרי להגדיל את האחסון מדגם למד, ובכך גם את הסכום הכולל של פפטידים אנדוגני. המורכבות של התערובת פפטיד בפילטר קיבל פניות כולל שלב הפוכה (RP) HPLC fractionation שלפני שלב ב- pH בסיסי לפני ניתוח LC-MS. Fractionation היה בשילוב עם ערכת שרשור פשוט שבו היו שברים 60 איחדו לתוך 12, ניתוח זמן הצריכה ובכך יופחת תוך הימנעות עדיין במידה רבה • תנאי שיתוף.
זיהוי אוטומטי פפטיד בוצעה באמצעות שלושה שונים אלקטרופיזיולוגיה זיהוי תוכנות ו לאחר מכן ומשלב את התוצאות. תוכניות השונות היו משלימים ולא דומה עם פחות מ 15% ההזדהויות חפפו בין שלוש.

השיטה המתוארת כאן חלה והיא מחושבת שלושה מחקרים לפני כניסתה של מדגם fractionation קדם (טבלה 1). המחקר הראשון משמש LC מנותק אכון CSF שברים על צלחת היעד MALDI וכתוצאה 730 פפטידים אנדוגני מזוהה11. במחקרים הבאים שני, תוויות isobaric הועסק. בעיקר בתוך פקד/תיק לבחינה וזיהוי הטזה של סמנים ביולוגיים פוטנצ...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid at JoVE.com

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

שיטה לניתוח spectrometric המוני של פפטידים אנדוגני האנושי נוזל מוחי שדרתי (CSF) מוצג. על ידי העסקת משקל מולקולרי ניתוק סינון, fractionation קדם כרומטוגרפי, המוני spectrometric ניתוח ושילוב עוקבות של פפטיד זיהוי אסטרטגיות, ניתן היה להרחיב את peptidome CSF ידוע כמעט כוחנו לעומת על מחקרים קודמים.

הכנת הדוגמא לניתוח Endopeptidomic ב אנושי נוזל מוחי שדרתי

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

שיטה משופרת עבור אוסף של נוזל של עכברים מורדם

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

ב Vivo הדמיה של התחבורה נוזל שדרתי דרך הגולגולת העכבר ללא שינוי באמצעות זריחה מאקרוסקופיה

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

הכנת פרוסות היפוקמפוס אנושיות חריפות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

A Pilot Study on the Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation of A&#946; and Tau Levels in Rhesus Monkey Cerebrospinal Fluid

A Pilot Study on the Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation of AÃƒÅ½Ã‚Â² and Tau Levels in Rhesus Monkey Cerebrospinal Fluid

מחקר פיילוט על הגירוי המגנטי הטרנס-גולגולתי החוזר ונשנה של רמות Aβ ו- Tau בנוזל השדרתי של קופי רזוס

Previous studies have demonstrated that a non-invasive light-flickering regime and auditory tone stimulation could affect A&#946; and tau metabolism in ...

Comprehensive Understanding of Inactivity-Induced Gait Alteration in Rodents

הבנה מקיפה של שינוי הליכה הנגרם על ידי חוסר פעילות במכרסמים

It is well known that disuse affects neural systems and that joint motions become altered; however, which outcomes properly exhibit these characteristics ...