Name: sample preparation for endopeptidomic analysis in human cerebrospinal fluid
Uploaded: 2017-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid at JoVE.com

Большое спасибо Танвир Батт и коллег за Советом в создании метода предварительно фракционирования.
Эта работа была поддержана финансирование от шведского исследовательского совета, Валлстрём и Шеблум фонд, пистолет и Бертиль СТОГНЕ фонд Stiftelse, Магнус Bergwall фонд, Фонд Åhlén, Alzheimerfonden, Demensförbundet, för Стифтельсен Gamla Tjänarinnor, кнут и Фонд Рауля Валленберга Алиса, Frimurarestiftelsen и Götalandsregionen FoU-Västra.
Основными получателями финансирования для этого проекта были Kaj Blennow, Хенрик Зеттерберг и Йохан Gobom.

Описанные ниже протокол является изысканной версии используется в предыдущем исследовании, где большое количество эндогенных пептиды были определены в человека ФГО15. Обновления для исходного протокола включают незначительные изменения к химической предварительной обр...

<ol>
	<li>Wimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+worldwide+costs+of+dementia+2015+and+comparisons+with+2010.">The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010.</a> Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).</li><li>Scheltens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).</li><li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer's+disease:+the+IWG-2+criteria.">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li><li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer's+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).</li><li>Spellman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+multiplexed+mass+spectrometry+based+assay+for+measuring+candidate+peptide+biomarkers+in+Alzheimer's+Disease+Neuroimaging+Initiative+(ADNI)+CSF.">Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).</li><li>H&#246;glund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease&#8212;Recent+biomarker+developments+in+relation+to+updated+diagnostic+criteria.">Alzheimer's disease&#8212;Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria.</a> Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).</li><li>Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+repertoire+of+human+cerebrospinal+fluid:+novel+proteolytic+fragments+of+neuroendocrine+proteins.">Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).</li><li>Yuan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebrospinal+fluid+peptidomics.">Human cerebrospinal fluid peptidomics.</a> J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).</li><li>Berven, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+influence+on+the+low+molecular+weight+cerebrospinal+fluid+proteome.">Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome.</a> Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).</li><li>Zougman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+the+cerebrospinal+fluid+peptidome+and+proteome.">Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome.</a> J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).</li><li>Holtta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidome+analysis+of+cerebrospinal+fluid+by+LC-MALDI+MS.">Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS.</a> PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).</li><li>Holtta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+workflow+for+multiplex+CSF+proteomics+and+peptidomics-identification+of+candidate+cerebrospinal+fluid+biomarkers+of+Alzheimer's+disease.">An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).</li><li>Hansson, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+cerebrospinal+fluid+endopeptidome.">Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome.</a> Proteomics. 17 (5), (2017).</li><li>Guldbrandsen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+characterization+of+the+cerebrospinal+fluid+(CSF)+proteome+displayed+through+the+CSF+proteome+resource+(CSF-PR).">In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR).</a> Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).</li><li>Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+human+cerebrospinal+fluid:+discovery+and+verification+of+biomarker+candidates+in+neurodegenerative+diseases+using+quantitative+proteomics.">Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics.</a> J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).</li><li>H&#246;ltt&#228;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+the+&#947;-secretase+inhibitor+semagacestat+alters+the+cerebrospinal+fluid+peptidome+in+humans.">A single dose of the &#947;-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans.</a> Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).</li><li>Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Comparison+of+Fractionation+Methods+for+In-depth+Analysis+of+Plasma+Proteomes.">Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes.</a> J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).</li><li>Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+peptide+fractionation+strategies+used+in+proteome+analysis.">Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis.</a> J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).</li><li>Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonality+of+separation+in+two-dimensional+liquid+chromatography.">Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+the+effect+of+urea+and+guanidinium+chloride+on+the+dynamics+of+unfolded+polypeptide+chains.">Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains.</a> J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).</li><li>Ho&#776;ltta&#776;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+Workflow+for+Multiplex+CSF+Proteomics+and+Peptidomics+Identification+of+Candidate+Cerebrospinal+Fluid+Biomarkers+of+Alzheimer&#8217;s+Disease.">An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer&#8217;s Disease.</a> J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).</li></ol>

Введение к ранее разработанный протокол для восстановления эндогенного пептидов шаг RP HPLC предварительно фракционирование высоком рН молекулярный вес ультрафильтрации11 снижение относительной выборки сложности и таким образом позволяет для 5 раз больше объем образца нео...

Биомаркеры в спинномозговой жидкости (CSF) в настоящее время превращения исследований в нейродегенеративных расстройств. В болезни Альцгеймера, наиболее распространенных нейродегенеративных расстройств, влияющих на более чем 60 миллионов человек во всем мире1,2, биомаркер триплет, состоящий из пептида амилоида бета, стабилизации микротрубочек белка Тау и фосфорилированных Тау формы, можно обнаружить болезнь с высокой чувствительностью и специфичностью и была включена в диагностических исследований критерии3. В других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и рассеянный склероз протеомических исследований выявили многочисленные биомаркера кандидатов, некоторые из которых в настоящее время оценки в клинические исследования4,5 ,6.
Наряду с белков СМЖ также содержит обилие эндогенного пептиды7,8,9,10,,1112. Составляя продукты расщепления многих мозга, полученных белков, эти пептиды также представляют собой потенциально важным источником болезни биомаркеров. Чтобы увеличить перечень выявленных эндогенного пептидов в человека Ликвора и включить ФГО endopeptidomic анализы в клинических исследованиях, был разработан метод для пробоподготовки и анализа LC-MS (схема краткий протокол были включены в Рисунок 1 ). Применение этого метода в недавнем исследовании привело к идентификации почти 16400 эндогенного ФГО пептидов в проб имелось спинномозговой жидкости от нескольких особей диагноз неспецифические, расширения известных endopeptidome ФГО десятикратный13. Метод при необходимости может использоваться в сочетании с Изобарический маркировки подход для количественной оценки.
Подготовка образца
Основным источником белка массы в спинномозговой жидкости является плазмы составляющих (например, альбумин и иммуноглобулины) прохождение крови мозга барьер14,15. Их высокое обилие затрудняет обнаружение низкого обильные, мозга, полученных образцов компонентов. Эндогенные пептиды могут быть легко отделены от высокой обильные протеины, тем самым позволяя значительно больший объем ФГО пептид экстракт использоваться для анализа LC-MS, тем самым позволяя обнаружения нижнего обильные пептидов.
В протоколе, представленные здесь молекулярный вес фильтрации производства (MWCO) был использован для отдельные пептиды спинномозговой жидкости от белковых фракций; метод, который был использован в нескольких предыдущих исследований8,9,10,11,12,16. Фильтрации шаг последовал автономной шаг до фракционирования RP ВЭЖХ, над градиентом высоком рН подвижная фаза. Выполнив два RP HPLC шаги в тандеме, с рН, что основное различие, разница в селективности между двумя этапами объясняется главным образом изменены пептид удержания вследствие разных пептидных обязанности государств. Применение предварительно фракционирование пептид высоком рН до LC-MS кислых условиях оказалась эффективной в повышении пептид идентификации17,18и даже превосходить для этой цели в сложных биологических по сравнению с более ортогональных разделения режимов19, как сильный Кот ионного обмена (SCX) и RP20образцов. Сократить время анализа, была использована схема объединения, объединения каждые 12 дробьй (например, дроби 1, 13, 25, 37 и 49), который благодаря высокой разрешающей способности RP HPLC по-прежнему в значительной степени избежать совместное Элюирующий пептидов из различных фракций в LC-MS шаг20,21.
Идентификация пептидов
Идентификация пептидов в peptidomic исследованиях отличается от протеомических исследований в том, что нет фермента расщепление может быть указано в поиск по базе данных, и как следствие, показатели идентификации обычно ниже11. Недавнее исследование13 показал, что уровень идентификации эндогенного пептиды, полученные с Sequest и талисман существенно были улучшены когда скоринга алгоритм программы соответствующего программного обеспечения по умолчанию была изменена с помощью адаптивного скоринга алгоритм, кофеварки, указав, что оптимальные алгоритмы скоринга для эндогенного пептиды отличается от tryptic пептидов13. В этом исследовании, идентификации на основе автоматического пептид de novo виртуализации с помощью программного обеспечения ПИКОВ (BSI) был найден будет дополнять два фрагмента Ион отпечатков пальцев-на основе поисковых систем, что приводит к значительно больший набор определенных пептиды.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1564">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:547px;">&#160;1 M Triethylammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:339px;">Fluka, Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:339px;">17902-100ML</td>
			<td style="width:339px;">TEAB</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">&#160;8 M Guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7294-100ML</td>
			<td>GdnHCl</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:547px;">Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>20490</td>
			<td>TCEP</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Iodoacetamide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td>IAA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Hydroxylamine 50% (w/w)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>457804-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-2L</td>
			<td>AcN</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Formic acid</td>
			<td>Fluka, Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>56302-1mL-F</td>
			<td>FA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Triflouroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508-10AMP</td>
			<td>TFA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>30501-1L-1M</td>
			<td>NH4OH</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td>MWCO-filter</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Sep-Pak C18, 100 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT023590</td>
			<td>SPE-column</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Resprep 12-port SPE Manifold&#160;</td>
			<td>Restek</td>
			<td>26077</td>
			<td>Vacuum manifold</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">TMT10plex Isobaric Label Reagent Set</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90110</td>
			<td>TMT10plex</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">UltiMate 3000 RSLCnano LC System</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>5200.0356</td>
			<td>Online sample separation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>IQLAAAGABHFAPBMBEZ</td>
			<td>Offline high-pH fractionation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:339px;">IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Mass spectrometer for sample analysis</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Proteome Discoverer 2.0&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGABSFAKJMAUH</td>
			<td>Proteomics search platform</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Mascot v2.4</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td style="width:339px;">&#160;-&#160;</td>
			<td>Proteomics search engine</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Sequest HT</td>
			<td>Thermo</td>
			<td style="width:339px;">&#160;-&#160;</td>
			<td>Proteomics search engine</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">PEAKS v7.5&#160;</td>
			<td>Bioinformatic Solutions Inc.)</td>
			<td style="width:339px;">&#160;-&#160;</td>
			<td>Proteomics search engine</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Acclaim PepMap 100, 75 &#181;m x 2 cm, C18, 100 &#197; pore size, 3 &#181;m particle size</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>164535</td>
			<td>Trap column (nano HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Acclaim PepMap C18, 75 &#181;m x 500 mm, 100&#197; pore size,&#160;2 &#181;m particle size</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>164942</td>
			<td>Separation Column (nano HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Savant SpeedVac High Capacity Concentrators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SC210A-230</td>
			<td>SpeedVac/Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">XBridge Peptide BEH C18 Column, 130&#197;, 3.5 &#181;m, 2.1 mm X 250 mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003566</td>
			<td>Separation Column (micro HPLC)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for endopeptidomic analysis in human cerebrospinal fluid

Этот протокол описывает метод для выявления эндогенного пептидов в человека спинномозговой жидкости (CSF). Для этой цели ранее разработанный метод, основанный на молекулярный вес производства (MWCO) фильтрации и масс-спектрометрических анализ в сочетании с шагом до фракционирования ВЭЖХ автономной высоком рН обратной фазы.
Секреция в спинномозговой жидкости является основным каналом для удаления молекул пролить клетки центральной нервной системы. Таким образом многие процессы в центральной нервной системе, отражены в спинномозговой жидкости, что делает его ценным диагностическим жидкости. CSF имеет сложные композиции, содержащие белки, которые охватывают диапазон концентрации 8-9 порядков. Кроме белков предыдущие исследования также продемонстрировали наличие большого числа эндогенного пептиды. В то время как менее широко изучены чем белков, они также может проводить потенциальный интерес как биомаркеров.
Эндогенные пептиды были отделены от содержание белка в спинномозговой жидкости через MWCO фильтрации. Удаляя большинство содержание белка из примера, можно увеличить объем образца учился и таким образом также общее количество эндогенного пептиды. Сложность смесь фильтруют пептид был рассмотрен, включая фазу обратный шаг до фракционирования ВЭЖХ (RP) в щелочной рН до анализа LC-MS. Фракционирование в сочетании с простой конкатенации схема, где 60 фракций были объединены в 12, потребление времени анализа может быть уменьшено таким образом все еще в значительной степени избегая совместное Элюирующий.
Автоматизированный пептид идентификации была выполнена с помощью трех разных пептидных/белков идентификации программ и впоследствии объединения результатов. Различные программы были взаимодополняющими, а не сопоставимы с менее чем 15% идентификаций, перекрываются между тремя.

Метод, описанный здесь применялся и оценены в трех исследованиях до введения образца до фракционирования (таблица 1). Первое исследование используется автономный LC для пятнать ФГО дроби на тарелку целевой MALDI и привели к11730 выявленных эндогенного пептиды. В двух следующих и...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid at JoVE.com

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Представлен метод для масс-спектрометрических анализа эндогенных пептидов в человека спинномозговой жидкости (CSF). Применяя молекулярный вес отключения фильтрации, хроматографического до фракционирования, масс-спектрометрических анализа и последующего сочетание стратегий идентификации пептид, удалось расширить известные ФГО peptidome почти в десять раз по сравнению с предыдущими исследованиями.

Пробоподготовки для анализа Endopeptidomic в цереброспинальной жидкости человека

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Изоляция цереброспинальной жидкости из грызунов эмбрионов для использования с расчлененный коры головного мозга Экспланты

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Мозги

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Высок объём анализ двигательного поведения в Assay остров дрозофилы

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

Усовершенствованный метод для коллекции спинномозговой жидкости от наркотизированных мышей

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

В Vivo Изображение цереброспинальной жидкости транспорт через Череп мыши Intact с помощью флуоресценции Макроскопия

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D кинематический анализ для функциональной оценки в Крыса Модель Сиатический нерв Давка травмы

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Кохлеарная поверхность Подготовка в взрослой мыши

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Подготовка острых человеческих гиппокампа для электрофизиологических записей

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

A Pilot Study on the Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation of A&#946; and Tau Levels in Rhesus Monkey Cerebrospinal Fluid

A Pilot Study on the Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation of AÃƒÅ½Ã‚Â² and Tau Levels in Rhesus Monkey Cerebrospinal Fluid

Пилотное исследование повторяющейся транскраниальной магнитной стимуляции уровней Aβ и Tau в спинномозговой жидкости макак-резусов

Previous studies have demonstrated that a non-invasive light-flickering regime and auditory tone stimulation could affect A&#946; and tau metabolism in ...

Comprehensive Understanding of Inactivity-Induced Gait Alteration in Rodents

Всестороннее понимание изменения походки, вызванного бездействием, у грызунов

It is well known that disuse affects neural systems and that joint motions become altered; however, which outcomes properly exhibit these characteristics ...