Name: live-imaging of breast epithelial cell migration after the transient depletion of tip60
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60 at JoVE.com

Nous remercions les membres du laboratoire JAI pour discussion utile et observations. S.J. a été pris en charge par des subventions de la National Research Foundation Singapour et le Singapour du ministère de l’éducation dans ses centres de recherche de l’initiative d’Excellence pour le Cancer Science Institute de Singapour (R-713-006-014-271), le National Medical Conseil de la recherche (CBRG-NIG ; BNIG11nov001 et CS-IRG ; R-713-000-162-511), le Fonds de recherche universitaire du ministère de l’éducation (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. et C.Y.T. ont été pris en charge par une bourse d’études supérieures décernée par l’Institut de Science Cancer de Singapour, National University of Singapore.

1. préparation
<ol><li>Préparer le milieu de culture MCF10A : moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco) / F12 (1:1) avec 5 % de cheval sérum, 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, 100 ng/mL de toxine de choléra et 10 µg/mL d’insuline.</li>
	<li>Préparer un milieu sans sérum : DMEM/F12 (1:1) avec 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, la toxine cholérique 100 ng/mL et 10 µg/mL d’insuline.</li>
	<li>Utilisez la séquence de siARN suivants ...

<ol>
	<li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM.">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li><li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53.">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li><li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Rvb1/Tip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60/NuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage.">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li><li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+TIP60.">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li><li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control:+many+tricks+in+one+HAT.">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li><li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity.">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction.">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li><li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis.">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li><li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration,+metastasis,+and+patient+survival.">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li><li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response.">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway.">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes.">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li><li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer.">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li><li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ligase+EDD1/UBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60.">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+from+dissemination+to+organ-specific+colonization.">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li><li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program.">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li><li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration.">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li><li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li></ol>

On sait que dans le processus de migration cellulaire, les cellules peuvent soit déplacer sous forme de feuilles adhérentes ; des grappes ; ou seul, isolés des cellules. Le mode et la dynamique de l’invasion des cellules peuvent varier d’une affection à l’autre, et le phénotype peut changer en quelques heures. L’analyse de cicatrisation traditionnelle est basée sur snapshot images tirées d’un microscope avec un intervalle de temps, par exemple 12 ou 24 h. Il est donc difficile de saisir la dynamique de...

VIH-Tat-interactive protéine de 60 kDa (TIP60) est une acétyltransférase de lysine qui peut acetylate histone et protéines non histones1,2. Ses fonctions sont trouvent à avoir des incidences sur les multiples voies de signalisation, y compris la transcription, la réparation de lésions de l’ADN et apoptose1,3,4,5,6, 7 , 8. en outre, TIP60 est souvent diminuée dans les cancers et sa diminution est corrélée avec métastases cancéreuses et faible taux de survie taux9,10,11,12, 13,14. Métastase tumorale est la principale cause de décès liés au cancer. C’est un processus en plusieurs étapes, et la première étape des métastases implique la migration et l’invasion des cellules tumorales dans les tissus adjacents15,16. Pour ce faire, les cellules tumorales, tout d’abord, doivent se détacher de la masse de la tumeur primitive, soit sous la forme d’une feuille de cellule collectivement envahisseurs ou comme détaché monocellules17. Pendant ce processus, les cellules tumorales connaissent souvent épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT), entraînant des changements dans la morphologie et la cellule adhérence capacité17,18.
Quelques techniques ont été développées pour étudier la migration et la capacité d’invasion de la tumeur des cellules in vitro. Parmi eux, l’essai de cicatrisation est le plus efficace et économique19. Tout d’abord, cette méthode implique la création d’un fossé artificiel sur une monocouche confluente de cellules, permettant ainsi aux cellules de migrer et de combler l’écart. Deuxièmement, les images des lacunes peuvent être capturés au début et à la fin de l’expérience. Enfin, une comparaison des écarts est utilisée pour déterminer la vitesse de la migration cellulaire. Un microscope à contraste de phase est généralement utilisé pour capturer des images pour des dosages classiques de cicatrisation. Un autre avantage de l’essai de la cicatrisation, c’est qu’il ressemble en partie en vivo migration des cellules tumorales. De même pour in vivo de métastases tumorales, la migration cellulaire lors d’essais de cicatrisation montre tant la migration collective des feuilles épithéliales et la migration des cellules simples jumelés.
Toutefois, la migration cellulaire est connue pour être dynamique, et il est nécessaire de documenter le mouvement des cellules en temps réel. Par exemple, un test conventionnel de cicatrisation ne permet pas un chercheur analyser les mouvements de la cellule unique. En revanche, les cellules cultivées pour des dosages de cicatrisation sont souvent privées de sérum pour inhiber la prolifération cellulaire. Ceci est fait pour écarter la possibilité d’écarts en raison de la prolifération cellulaire. Néanmoins, il y aura toujours quelques prolifération et mort cellulaire et des images à contraste de phase prises avant et après l’expérience sont incapables de différencier entre eux.
La technique d’imagerie de cellules vivantes aborde cette limitation des essais classiques de cicatrisation. En utilisant un microscope de vivre-imagerie combiné avec un incubateur à CO2 et le contrôle de température approprié, chercheurs peuvent de mesurer la taille de l’espace et son taux de fermeture au fil du temps tout en retraçant les mouvements de migration activement les cellules situées à l’extrémité de la avant envahissante. Par conséquent, la mise en œuvre de cellules vivantes d’imagerie pour surveiller la migration cellulaire ne fournira pas seulement la meilleure visualisation de la migration cellulaire, mais permettra également la possibilité de faire la différence entre la migration cellulaire et la prolifération cellulaire, permettant ainsi une plus fiabilité de l’analyse de la migration cellulaire.
Dans cette étude, les cellules épithéliales mammaires MCF10A servaient à démontrer la combinaison de la cicatrisation, dosage et vivre-cellule d’imagerie afin d’étudier le rôle de TIP60 dans la migration cellulaire. L’appauvrissement de la couche de TIP60 résulte en capacités d’augmentation de la migration dans les cellules MCF10A.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MCF10A cell</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-10317TM</td>
			<td style="width:257px;">Breast epithelial cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM/F12 media (1:1)</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Epithelial growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:211px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cholera Toxin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C-8052</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-0888</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Insulin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I-1882</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">House serum</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trypsin</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>For MCF10A detach from plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">267110</td>
			<td>For counting cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Opti-MEM reduced serum media</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td>For siRNA mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">56532</td>
			<td>Transfect reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15596-026</td>
			<td>For mRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-8891</td>
			<td>For cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">172-5125</td>
			<td>For real time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">7500 Fast Real Time PCR system</td>
			<td style="width:211px;">Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Real time qPCR mechine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">10-cm dish</td>
			<td style="width:211px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">664160</td>
			<td>For Knockdown experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">24-well plate</td>
			<td style="width:211px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td>For wound healing assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siControl siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siTIP60 siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Live cell observer</td>
			<td style="width:211px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of breast epithelial cell migration after the transient depletion of tip60

L’essai de cicatrisation est efficace et l’un des moyens plus économiques pour l’étude de migration cellulaire in vitro. Classiquement, les images sont prises au début et la fin d’une expérience à l’aide d’un microscope à contraste de phase, et les capacités de migration des cellules sont évaluées par la fermeture des plaies. Cependant, le mouvement cellulaire est un phénomène dynamique, et une méthode conventionnelle ne permet pas pour le suivi de mouvement de cellule unique. Afin d’améliorer les tests de cicatrisation actuellement, nous utilisons les techniques d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller la migration cellulaire en temps réel. Cette méthode permet de déterminer le taux de migration cellulaire basé sur une cellule, système de suivi et fournit une meilleure distinction entre la migration cellulaire et la prolifération cellulaire. Ici, nous montrent l’utilisation de l’imagerie de cellules vivantes dans des essais de cicatrisation pour étudier les capacités différentes de migration des cellules épithéliales mammaires, influencées par la présence de TIP60. Motilité cellulaire est très dynamique, notre méthode fournit plus d’idées dans les processus de cicatrisation qu’un instantané de la fermeture de la plaie avec les techniques d’imagerie traditionnels utilisés pour les essais de cicatrisation.

Schéma général du test de Migration cellulaire axée sur l’imagerie de cellules vivantes Figure 1 a est un schéma du présent protocole. MCF10A cellules transfectées avec siControl a montré une morphologie épithéliale typique. Après l’épuisement des TIP60, MCF10A cellules étaient plus mésenchymateuses par rapport aux cellules témoins (Figure 1 b).
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Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Vivre-imagerie de la Migration des cellules épithéliales mammaires après la diminution transitoire des TIP60

Nous présentons ici la surveillance en temps réel de la migration cellulaire dans un essai de cicatrisation avec les cellules épithéliales mammaires appauvri TIP60 MCF10A. La mise en œuvre de techniques d’imagerie de cellules vivantes dans notre protocole nous permet d’analyser et de visualiser les unicellulaires mouvement en temps réel et au fil du temps.

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

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