Name: live-imaging of breast epithelial cell migration after the transient depletion of tip60
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00
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私たちは彼らの役に立つ議論とコメントの Jha 研究室のメンバーに感謝します。スバールバルヤンマイエン島がん科学研究所シンガポール (R-713-006-014-271)、国立医学国立研究財団にシンガポール、シンガポールの教育省卓越性イニシアチブの各研究センターの下からの補助金に支えられ研究協議会 (CBRG 遺伝研;BNIG11nov001 と CS-IRG;R-713-000-162-511)、文部省学術研究基金 (萌え AcRF 層 1 T1 2012 10 月 -04)。Y.Z.、G.S.C.、および C.Y.T. は、がん科学研究所のシンガポール、シンガポールの国立大学によって授与卒業後奨学金によって支えられました。

1. 準備
<ol><li>MCF10A 培養液の準備: ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) F12 (1:1) 5% 馬の血清、20 ng/mL 上皮成長因子、0.5 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 ng/mL コレラ毒素、10 μ g/mL インスリン/。</li>
	<li>無血清培地の準備: 20 ng/mL 上皮成長因子、0.5 mg/mL ヒドロコルチゾン、100 ng/mL コレラ毒素と 10 μ g/ml インスリン DMEM/f12 キー (1:1)。</li>
	<li>次の siRNA シーケンスを使用します。 siControl: フォワード: ...

<ol>
	<li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM.">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li><li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53.">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li><li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Rvb1/Tip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60/NuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage.">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li><li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+TIP60.">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li><li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control:+many+tricks+in+one+HAT.">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li><li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity.">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction.">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li><li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis.">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li><li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration,+metastasis,+and+patient+survival.">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li><li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response.">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway.">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes.">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li><li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer.">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li><li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ligase+EDD1/UBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60.">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+from+dissemination+to+organ-specific+colonization.">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li><li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program.">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li><li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration.">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li><li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li></ol>

細胞移動の過程で細胞は付着性シートの形でどちらかの移動ことができます知られています。ゆるい房;または、隔離された単一のセルです。モードと細胞浸潤の動的することができます 1 つの条件ごとに異なると表現型が時間内で変更できます。伝統的な創傷治癒のアッセイは、12 または 24 h など、長い時間間隔と顕微鏡から撮影したスナップショット画像に基づいています。傷の閉鎖のダ...

HIV Tat インタラクティブ蛋白質 60 kDa (TIP60) はヒストンと非ヒストン蛋白質1,2の両方ことができる従ってリジン アセチルトランスフェラーゼです。その機能は転写、DNA 損傷修復、およびアポトーシス1,3,4,5,6,を含む複数のシグナル伝達経路に影響があることが判明します。7,8しますさらに、TIP60 はしばしば癌のダウンレギュ レートのダウンレギュレーションがん転移と相関していると貧しい人々 の生存率は9、10、11,12、。 13,14。腫瘍の転移は癌関連死の主要な原因です。それはマルチ ステップ プロセスと移行と隣接する組織15,16に腫瘍細胞の浸潤、転移の最初のステップが含まれます。そのためには、腫瘍細胞はまず原発腫瘍固まり、総称して侵入した細胞シートの形式のいずれかからデタッチする必要があります。 またはとして単一セル17戸します。このプロセス中に腫瘍細胞はしばしば上皮間葉転換 (EMT) 形態と細胞接着機能17,18変更を伴うに受けること。
移行を検討するいくつかの手法が開発されて、培養細胞の浸潤性腫瘍。その中で、創傷治癒の試金は最も効率的で経済的な19です。まず、この方法は、細胞、細胞に移行し、ギャップを埋めるようにコンフルエント単層の人工ギャップの作成を含みます。第二に、実験の前後でのギャップの画像をキャプチャできます。最後に、ギャップ閉鎖の比較を使用して、細胞の移動の速度を決定します。位相差顕微鏡は通常従来の創傷治癒の試金のための画像をキャプチャする使用されます。創傷治癒の試金のもう一つの利点は、生体内で腫瘍細胞の遊走が一部似ているです。同様に腫瘍転移生体内でアッセイの創傷治癒過程で細胞の移動は上皮シートの集団の移動と独立した単一細胞の移動を示します。
細胞遊走は動的である知られているし、リアルタイムで細胞の動きを文書化する必要があります。例えば、従来の創傷治癒の測定は単一セルの動きを分析する研究者を許可しません。一方、創傷治癒アッセイ用細胞は、しばしば、血清飢餓細胞増殖を抑制します。これは細胞増殖のためギャップ閉鎖の可能性を排除するためです。それにもかかわらず、されますが、いくつかの増殖と細胞死、位相差像の実験はそれらを区別することができる前に撮影します。
生細胞イメージング技術従来の創傷治癒の試金のこの制限に対処します。ライブ イメージング顕微鏡を用いた CO2インキュベーターと適切な温度制御と組み合わせることで、研究者はギャップの大きさを測定できるし、の先端に位置する細胞積極的に移行の動きをトレースしながら時間をかけて閉鎖率、侵襲的なフロント。つまり、住セルイメージ投射細胞の移動を監視するための実装セル移行のより良い視覚化を提供しませんが、また、細胞遊走と細胞増殖より提供を区別する可能性のよう細胞遊走の信頼性の高い解析。
本研究では MCF10A 乳腺上皮細胞は創傷治癒の試金と住セルイメージ投射細胞遊走の TIP60 の役割を研究するの組み合わせを示すため使用されました。MCF10A 細胞内移行能力 TIP60 の枯渇の結果します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MCF10A cell</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-10317TM</td>
			<td style="width:257px;">Breast epithelial cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM/F12 media (1:1)</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Epithelial growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:211px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cholera Toxin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C-8052</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-0888</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Insulin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I-1882</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">House serum</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trypsin</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>For MCF10A detach from plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">267110</td>
			<td>For counting cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Opti-MEM reduced serum media</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td>For siRNA mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">56532</td>
			<td>Transfect reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15596-026</td>
			<td>For mRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-8891</td>
			<td>For cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">172-5125</td>
			<td>For real time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">7500 Fast Real Time PCR system</td>
			<td style="width:211px;">Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Real time qPCR mechine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">10-cm dish</td>
			<td style="width:211px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">664160</td>
			<td>For Knockdown experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">24-well plate</td>
			<td style="width:211px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td>For wound healing assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siControl siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siTIP60 siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Live cell observer</td>
			<td style="width:211px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of breast epithelial cell migration after the transient depletion of tip60

創傷治癒の試金は効率的な細胞移行の培養を研究する最も経済的な方法の一つ。従来、画像は位相差顕微鏡を用いた実験の前後に撮影が、傷の閉鎖によって細胞の移行の能力が評価されます。ただし、細胞運動は動的な現象を単一セルの動きを追跡するため、従来の方法を指定することはできません。現在の創傷治癒のアッセイを向上させるため、生細胞イメージング技術を使用して、リアルタイムで細胞の移動を監視します。このメソッドは、追跡システムのセルに基づいてセル移行レートを決定することができます、細胞遊走と細胞増殖との間の明確な区別を提供します。ここでは、我々 は TIP60 の存在によって影響を受ける乳房の上皮細胞のさまざまな移行能力を研究するためのアッセイの創傷治癒の生きているセルイメージ投射の使用を示します。細胞の運動性は非常にダイナミックな私たちのメソッドは創傷創傷閉鎖創傷治癒の試金のためのイメージングの伝統の技術で撮影したスナップショットよりも治癒のプロセスに洞察力を提供します。

生細胞イメージングに基づく細胞移行試験の一般的なスキーマ 図 1 aは、このプロトコルのスキーマです。典型的な上皮形態を示した siControl MCF10A セルをトランスフェクトしました。TIP60 の枯渇後、MCF10A 細胞いたより間葉系細胞 (図 1 b) と比較しています。
<strong...

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Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

乳腺上皮細胞移行 TIP60 の一時的な枯渇後のライブ イメージング

ここでは、TIP60 枯渇 MCF10A 乳房の上皮細胞を用いた創傷治癒のアッセイで細胞遊走のリアルタイム モニタ リングを提案します。生細胞イメージング プロトコルの実装を分析し、リアルタイムの時間の単一細胞運動を可視化することができます。

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