Name: rgb and spectral root imaging for plant phenotyping and physiological research: experimental setup and imaging protocols
Uploaded: 2017-08-08T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
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Die Autoren erkennen Mittel aus der Wissenschaftsfonds FWF über das Projekt Nummer P 25190-B16 (die Wurzeln der Dürreresistenz). Errichtung der hyperspektralen Bildgebung Infrastruktur wurde von der föderalen Regierung von Niederösterreich (Land Niederösterreich) über das Projekt K3-F-282/001-2012 finanziell unterstützt. Zusätzliche Mittel für die Zuckerrüben-Experiment von AGRANA Forschung empfangen wurde &#38; Innovation Center GmbH (ARIC). Die Autoren danken Craig Jackson für den technischen Support während des Experiments und Englisch Korrektur des Manuskripts. Wir erkennen auch Markus Freudhofmaier, die zur Einrichtung der RGB Bildgebende Einrichtung beigetragen und Josef Schodl für den Bau der Rhizobox Montage.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Protokolle bieten zwei komplementäre Ansätze für Boden gewachsen Wurzelsystem Bildgebung. Ein entscheidender Schritt für die zuverlässige experimentelle Ergebnisse ist von der Rhizoboxes Füllung, die eine gleichmäßige und homogene Substratschicht an der Frontscheibe zu engen Wurzel-Bodenschluss an das Beobachtungsfenster und vermeiden Luftspalte zu gewährleisten. Dies ist der Hauptgrund für die vergleichsweise gut gesiebten Boden verwenden &#60; 2 mm: höhere Oberflächenmorphologie am Sichtfenster mit Hohlräumen zwischen den Aggregaten führen zu größere Aggregaten. Neben ein höheres Risiko der Wurzel Tipp Dehydrierung erfordert dies auch komplexere Bildverarbeitungstechniken für Wasser Abbildung31.
Änderungen des Protokolls konzentrieren sich deshalb auf verbesserte und schnelle Befüllung des Rhizoboxes. Derzeit Füllzeit ist ca. 30 Minuten pro Box. Des weiteren Verwendung von Rhizoboxes mit zwei Glasfenster für die Bildgebung von beiden Seiten und Änderungen an Homogenität der Ausleuchtung für bessere RGB-Bilder optimieren werden getestet. Weitere Hardware-Erweiterung sollten auch Integration von planaren Optodes32 sowie Kapazität imaging33 in das Rhizobox-System. Dies ist jedoch darüber hinaus aktuelle Upgrade Aktivitäten.
Softwareänderungen konzentrieren sich auf automatische Bild-Registrierung zur Sicherung oben und unten RBG Bilder34. Bildgebendes erweiterte unbeaufsichtigt Merkmalsextraktion Ansätze für hyperspektrale28 sowie empfindlicher betreute Ziel Nachweismethoden, wie z. B. SVMs35 getestet. Dabei erlauben die hyperspektrale Daten möglicherweise für die Bewertung von mehreren Boden, Rhizosphäre und Wurzel Eigenschaften36. Außerdem soll es eine (Semi) entwickeln automatisierte Software für Rhizobox Wurzel Bilder basierend auf einer modifizierten Version des Root-System Analyzer37 , morphologische zu quantifizieren (Länge, Durchmesser, Fläche) sowie architektonische Merkmale (Verzweigung Frequenz, Verzweigung Winkel).
Die wichtigste Einschränkung des Protokolls im Vergleich zu 3D imaging Ansätzen ist die Beschränkung auf die Oberfläche sichtbare Wurzel und Rhizosphäre Eigenschaften. Jedoch wurde nachgewiesen, dass die sichtbare Wurzel Züge einen zuverlässigen Proxy für das gesamte Wurzelsystem21sind. Die Rhizobox Technik ist leicht mit traditionellen destruktive Probenahme (waschen) am Ende der Wachstumsdynamik imaging um das Verhältnis von sichtbaren vs. total Wurzelsystem Züge zu validieren kombiniert. Da diese Beziehung unter den Arten21variieren könnten, empfiehlt destruktive Probenahme zuverlässige Ableitung von sichtbaren Merkmale für jede neue Phänotypisierung Serie mit verschiedenen Kulturarten zu gewährleisten.
Der entscheidende Vorteil des hier vorgestellten Protokolls ist die Kombination von realistischen Wachstumsbedingungen (Boden), relativ hohen möglichen Durchsatz für die zeitlich aufgelöste RGB Bildgebung und Rückschlüsse auf die Wurzel Funktionalität (z.B. Wasseraufnahme) über die chemometrischen Wurzel und Rhizosphäre Daten aus hyperspektralen Bildgebung. Dabei überwindet die Methoden Inferenz Einschränkungen im Hochdurchsatz Sämling und nicht Boden Wurzel bildgebende Methoden14, während es teilweise tiefen Phänotypisierung Einblicke in funktionale Prozesse mit weniger experimentell Komplexität und höheren Durchsatz im Vergleich zu modernen 3D Methoden15ermöglicht.
In kommenden Experimenten das Protokoll wird verwendet, um die Wirkung der Mykorrhiza auf Root-Systementwicklung und Funktionalität von Leguminosen sowie für Phänotypisierung Wurzel Merkmale der Zwischenfrucht Arten in Bezug auf die Bodenstruktur, Stickstoff und Kohlenstoff zu studieren Radfahren.

Wurzeln geben mehrere wesentliche Funktionen für Pflanzen wie Lagerung von in sich aufnimmt, Verankerung der terrestrischen Pflanzen im Boden, und Aufnahme und Transport von Wasser und Nährstoffen1. Aus evolutionärer Sicht gilt die Bildung der Wurzel Achsen eine grundlegende Voraussetzung für die Entstehung von Land Pflanzen2. Trotz dieser wichtigen Rolle haben Wurzeln historisch nur eine marginale Position in der biologischen Forschung besetzt. In neuerer Zeit jedoch steigt wissenschaftliches Interesse an der Pflanze-Wurzel-Systeme wie in Abbildung 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Relevanz der Wurzel Studien in Pflanzenwissenschaften. Anzahl der Wurzel Studien im Zusammenhang als Prozentsatz aller veröffentlichten Werk Studien in SCI-Zeitschriften in den letzten Jahrzehnten. Suchergebnis von Scopus mit Schlüsselwörtern "Pflanze" und "Pflanze und Wurzel". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Zwei Hauptgründe können vermutet werden, um die jüngsten Fortschritte in der Wurzel Forschung zugrunde liegen. Erste, terrestrische Vegetation ist häufiger Umweltbelastungen infolge globaler Wandel3ausgesetzt. Im Rahmen der landwirtschaftlichen Pflanzenproduktion wird geschätzt, dass weltweit rund 30 % der landwirtschaftlichen Nutzfläche durch Wasser und Phosphor4,5begrenzt sind. Stressabbau der Ernteerträge sind ein Hauptgrund für erhebliche Ausbeute Lücken, die unteren 50 % der möglichen Produktivität für Rainfed Agrarökosysteme6weltweit geschätzt werden. Neben niedrigen Ressourcenverfügbarkeit ist dies auch schlechte Nutzung Ressourceneffizienz, d.h. ausreichender Kapazität einer Anlage zur verfügbaren Ressourcen7nutzen zusammen. Dies führt zu Verlusten von mobilen Ressourcen wie Nitrat die andere Ökosysteme negativ beeinflussen können. Die aktuelle globale Verwendung Stickstoffeffizienz beläuft sich beispielsweise auf 47 %8. Bessere Ressourcennutzung Effizienz durch verbesserte Managementmethoden und Sorten ist daher von großer Bedeutung sowohl für nachhaltiges Wachstum der landwirtschaftlichen Ausgänge sowie für ökologische Nachhaltigkeit. In diesem Kontext Pflanze Wurzeln gelten eine wichtige Zielgruppe für bessere Ernten und Zuschneiden Systeme9,10.
Ein zweiter wichtiger Hintergrund für das aktuelle Interesse an Pflanzenwurzeln ist technologischer Fortschritt in der Messmethoden. Root-Methoden haben lange von zwei zentralen Herausforderungen eingeschränkt worden: für die Messung der Wurzeln von Pflanzen, die wachsen im Boden isoliert für die Quantifizierung, werden meist durch Waschen11, mussten dabei stören die architektonische Anordnung der Wurzel Achsen. In-Situ -Wurzel-Beobachtung mit Ausgrabung Methoden, dadurch erhalten die natürliche Lage der Wurzeln im Boden, für botanische Beschreibung12verwendet worden. Sie sind sehr zeitaufwendig und somit erfüllen nicht die Anforderungen an den Durchsatz der vergleichende strukturelle funktionelle Wurzelsystem Analyse. Auf der anderen Seite waren Hochdurchsatz-Methoden zur Wurzel Architektur Messung meist erfolgt auf künstliche Medien und für Setzling Pflanzen13 wo die Extrapolation auf die natürlichen Wachstums Umwelt Pflanzen fraglich14.
Der jüngste Boom der Wurzel Forschung ist eng mit der Fortschritt im Bereich der bildgebenden Methoden15verbunden. Imaging-Ansätze in der Wurzel Studien kann grob in drei Typen gruppiert werden. Erstens gibt es hochauflösende 3D Verfahren wie CT und MRT16. Diese Methoden eignen sich Interaktionsprozesse der Pflanzenwurzeln mit dem Boden, zu studieren wie Dürre Xylem Embolie17induziert. In der Regel sind sie vergleichsweise kleine Proben zugewiesen, wo sie detaillierte Beobachtungen erlauben. Ein Vergleich der CT und MRT für unterschiedlich große Töpfe und feinen Wurzel Imaging ist in18vorgesehen. Zweitens gibt es Hochdurchsatz-bildgebenden Methoden19,20. Diese Methoden sind meist basierend auf gemeinsamen 2D RGB Darstellung der Wurzeln wachsen auf künstliche Medien (Gel, Keimung Papier), wo hoher Kontrast ermöglicht vergleichsweise einfache Dissektion zwischen Wurzeln und Hintergrund. Sie eignen sich für hohen Durchsatz Vergleich zwischen Sämling Wurzel Merkmale der verschiedenen Ernte Genotypen unter standardisierten künstlichen wachsenden Bedingungen13. Zwischen diesen beiden Ansätzen werden Rhizobox Methoden: sie verwenden 2D Darstellung der Wurzeln wachsen im Boden über längere Zeit und haben mittleren Durchsatz21,22. Eine aktuelle Herausforderung an (2D) Wurzel Bildgebung soll auch Indikatoren für die Wurzel Funktionalität neben der Beschreibung der Struktur23erfassen.
In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir die experimentelle Protokolle für imaging Rhizobox Wurzelsysteme mit (i) eine günstige und einfache maßgeschneiderte RGB bildgebenden Setup und (Ii) ein komplexeres NIR bildgebenden Setup gewachsen. Beispielergebnisse aus diesen zwei Setups werden gezeigt und diskutiert im Zusammenhang mit der Anlage Phänotypisierung und physiologischen Pflanzenforschung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rhizobox</td>
			<td>Technisches B&#252;ro f&#252;r Bodenkultur</td>
			<td>Experimental builder</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Lamps ATUM HORTI 600</td>
			<td>Klutronic</td>
			<td>AHI10600F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent light tube HiLite T5 Day</td>
			<td>Juwel Aquarium</td>
			<td>86324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light tube Eurolite 45cm slim 15 W</td>
			<td>Conrad</td>
			<td>593384 - 62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon EOS 6D</td>
			<td>Canon Austria GmbH</td>
			<td>8035B024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32</td>
			<td>Adobe Systems Software Ireland Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinRhizo Pro v. 2013</td>
			<td>Regent Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeva-1.7-320 SWIR camera</td>
			<td>Xenics</td>
			<td>XEN-000105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrograph Imspector N25E</td>
			<td>Specim</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperspectral imaging scanner</td>
			<td>Carinthian Tech Research AG</td>
			<td>Experimental builder</td>
			<td>Design and assemblage of Hyperspectral Imaging Scanner and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab R2106a</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Including Toolboxes for Image Processing, Signal Processing and Statistics and Machine Learning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP4 Poromoeter</td>
			<td>Delta-T-Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-3100C Area Meter</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASF Styradur polystyrene sheets</td>
			<td>Obi Baumarkt</td>
			<td>9706318</td>
			<td>Different types of polystyrene sheets or other material separating differently moistured soil can be used</td>
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</table>

rgb and spectral root imaging for plant phenotyping and physiological research: experimental setup and imaging protocols

Besseres Verständnis der Pflanze Wurzel Dynamik ist wesentlich zur Verbesserung der Ressourceneffizienz Nutzung landwirtschaftlicher Systeme und erhöhen die Widerstandskraft der Ernte Sorten gegen Umweltbelastungen. Ein experimentelles Protokoll ist für RGB und hyperspektralen Bildgebung des Wurzelsystems vorgestellt. Der Ansatz verwendet Rhizoboxes, wo Pflanzen wachsen in natürlichen Böden über einen längeren Zeitraum voll entwickeltes Wurzelsystem zu beobachten. Experimentelle Einstellungen sind beispielhaft für die Bewertung Rhizobox Pflanzen unter Wasserstress und Untersuchung der Rolle von Wurzeln. Eine RGB-Image-Setup wird für günstige und schnelle Quantifizierung der Wurzelentwicklung im Laufe der Zeit beschrieben. Hyperspektrale Bildgebung verbessert die Segmentierung der Wurzel aus dem Boden-Hintergrund im Vergleich zu RGB-Farbe Schwellwerte. Die besondere Stärke der hyperspektralen Bildgebung ist der Erwerb von chemometrischen Informationen über das Wurzel-Boden-System für funktionales Verständnis. Dies wird mit hoher Auflösung Wasser Content Mapping gezeigt. Spektralen Bildgebung ist jedoch viel komplexer in Bilderfassung, Verarbeitung und Analyse im Vergleich zu den RGB-Ansatz. Eine Kombination beider Methoden kann eine umfassende Bewertung des Wurzelsystems optimieren. Anwendungsbeispiele, die Integration von Wurzel und oberirdische Züge sind für den Kontext der Phänotypisierung und Pflanze physiologischen Pflanzenforschung gegeben. Weitere Verbesserung der Wurzel Bildgebung erhalten Sie durch die Optimierung der Bildqualität RGB mit bessere Ausleuchtung mit verschiedenen Lichtquellen und durch Verlängerung der Bildanalyseverfahren auf Wurzel Zoneneigenschaften von spektralen Daten abzuleiten.

Example results are presented for root segmentation based on RGB and HS imaging. For spectral imaging an example of high resolution water mapping is provided. Finally results are shown that demonstrate the scientific context where image based root data are applied.
RGB based root measurement
Figure 8 shows an RGB root image time series of sugar beet cultivar Ferrara. The images reveal some artefacts from inhomogeneous illumination of the rhizoboxes, with brighter areas along the left side and different brightness at the overlapping area between top and bottom images.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig8.jpg" /> 
Figure 8: Root growth time series from the RGB imaging. 
Pictures show the sugar beet cultivar Ferrara at different days after sowing (DAS). The images show some artefacts due to non-homogeneous illumination at the left side of the image and between top and bottom images. Scale bars, 2 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig8large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Figure 9 provides details on root segmentation based on color thresholding for cultivar Ferrara at day after sowing (DAS) 35. As a reference (Figure 9A), a binary image is used where all roots were manually tracked with a Graphic Tablet. The time required for manual tracking of the entire, fully developed, dense sugar beet root system was around four hours. Figure 9B gives a detailed view on a selected area at the top of the image where old lateral roots are present. Here several root axes are not classified by the color threshold. At the bottom (Figure 9C) on the contrary, where white young roots are predominant, the color based segmentation properly classifies all root axes. The binarized root system (Figure 9D) shows a black area at the left side from the illumination artefact which was defined as exclusion region before running quantitative analysis. Figure 9E shows the corresponding pixel histograms of selected features (roots vs. soil) for the red channel of the RGB image from Ferrara at DAS 35. The root pixels (blue color) clearly show three peaks corresponding to bright young laterals, dark old laterals and tap root. The overlap between the old laterals and the soil background is very strong, leading to unclassified root axes (cf. Figure 9B).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig9.jpg" /> 
Figure 9: Root segmentation using a color threshold. 
(A) Manually segmented root system using a Graphic Tablet, (B) area with poorly segmented old root axes in the top and (C) properly segmented young axes in the bottom of the image, and (D) binary image obtained from color based thresholding. (E) Pixel histograms for selected features of the RGB image. Roots are represented by the blue bars with different root types indicated; soil is represented by the red bars. Scale bars in A and D, 2 cm; scale bars in B and C, 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig9large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The resulting total visible root length quantified for the manually segmented reference image is 1534.1 cm, while the automatized, color based segmentation gives a total root length of 1427.6 cm.
Greyscale images from UV-illumination do not provide an advantage in the case shown here and performed worse compared to color thresholding (root length: 1679.7 cm). Old roots could not be segmented, and there was more noise in the image, probably due to lower light intensity of the UV lamps. However, in case of young roots with high auto-fluorescence and a bright background substrate, UV-illumination can still be an option as shown by an image obtained from another experiment where sand was used as background substrate (Figure 10).
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig10.jpg" /> 
Figure 10: UV illumination to visualize roots on bright background. 
Example from a durum wheat root system growing in a rhizobox filled with quartz sand. The rhizobox is imaged with illumination for (A) UV light and (B) fluorescent (day) light. Scale bars, 2 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig10large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
HSI based root measurements
Figure 11 provides the mean spectra for three root ROIs (old and young lateral, tap root) and two soil ROIs (top and bottom of rhizobox).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig11.jpg" /> 
Figure 11: Mean spectra of root and soil. 
Spectra from regions of interest (ROIs) on the root (three root types) and in the soil (top and bottom of the rhizobox). The ROIs are selected to determine an optimum segmentation criterion between root and soil. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig11large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
It is evident that the tap and young lateral roots differ substantially from the background in intensity of most spectral bands. For the old laterals the intensity differences are much lower. A feature that can be inferred visually is the different slope of the spectrum around water absorption region (1450 nm). Here the slope of root spectra is higher compared to soil spectra. Furthermore a change of tap and young lateral spectra in the region around 1100 nm can be identified that does not occur in the old laterals.
Figure 12A shows the result from the search algorithm identifying a spectral ratio with strongest foreground-background contrast. The ratio of spectra at 1476 nm to 1076 nm provides the best separation between roots and soil. The resulting histogram of root foreground and soil background pixels is shown in Figure 12B. Although there is some overlap, most pixels are clearly separated from the soil background. Fitting a bimodal Gaussian curve through the histogram and using Bhattacharyya distance for quantification, a value of 7.80 is obtained. A value higher 3.0 indicates strong image contrast allowing reliable separation28.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig12.jpg" /> 
Figure 12: Difference in reflectance between root foreground and soil background for different spectral band ratios and pixel histogram at spectral ratio used for segmentation. 
(A) Bright colors (yellow) show high contrast between foreground and background, dark colors (blue) show low contrast. The first 15 bands have been removed because of noise. The red lines indicate the band ratio with highest contrast. (B) Pixel histogram of roots (blue) and soil (red) at segmentation spectral ratio. Blue bars represent the root and red bars the soil. The intensity value corresponds to the ratio of spectral band 160 to spectral band 49. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig12large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The binary image (Figure 13) is created by applying a global intensity threshold of the identified spectral ratio at a value of 1.008 calculated from the histogram distance27. Analysis of root length of this image gives a total length of 1557.3 cm which represents an error of only 1.5% compared to the manually tracked reference image.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig13.jpg" /> 
Figure 13: Binary image of the root system of sugar beet cultivar Ferrara. 
The image is obtained by applying a global spectral threshold. Scale bar (bottom left corner), 2 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig13large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Although root segmentation has improved using spectral information compared to color based information, the main intention of HS imaging is analysis of chemometric image properties. This is exemplified via mapping the water content of a rhizobox image.
Figure 14A shows the mean spectra of the compartments in the calibration rhizobox (cf. Figure 7) filled with soil of different water content. The shape of spectra is similar between the compartments, i.e. here a spectral ratio does not necessarily provide a more stable classification criterion. Thus intensity at a single spectral band (1680 nm), where the average difference between adjacent water contents is maximized, is identified as best separating criterion. The resulting pixel histograms for this spectral wavelength are shown in Figure 14B.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig14.jpg" /> 
Figure 14: Spectral features for water content calibration. 
(A) Mean spectra of nine water compartments from the calibration rhizobox with different water contents; (B) Pixel histograms for the water compartments at band 216 where average distance between neighboring compartment is maximum. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig14large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The relation of the average pixel intensity at 1680 nm and the measured water content is shown in Figure 15.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig15.jpg" /> 
Figure 15: Relation of spectral reflectance and volumetric water content. 
The figure shows data pairs of measured water content and spectral reflectance with empirical curves (linear and exponential) fit to the data excluding the highest water contents (red triangles). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig15large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Differentiation of higher water contents from spectral intensity becomes difficult. A significant regression (either linear or exponential) with high R2 can be fit to water contents up to around 0.30 cm3 cm-3. Wetter soil conditions cannot be reliably predicted by the intensity value. Similar behavior of an exponential relation between reflectivity and water content with a decreasing response to water contents higher 0.30 cm3 cm-3 was also found in other studies30.
A rhizobox image with fine mapping of water content is shown in Figure 16. Four aspects have to be remarked. First, a region of lower water content can be seen in the rooted parts of the rhizobox. Second, strongest depletion is concentrated in the vicinity to single root axes. Third, depletion zones also occur where no root axes are visible on the surface, indicating regions where roots are hidden in soil. Fourth, water mapping without further image-processing results in a patchy appearance due to the aggregated soil. This can indicate inhomogeneous water content distribution at the aggregate scale, but also surface morphology effect on image quality. Chemometric image-processing techniques are an option to overcome such morphological effects in spectral images31, but are not implemented so far in the Matlab scripts used here.
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig16.jpg" /> 
Figure 16: Water content mapping on a rhizobox. 
The dark blue colours represent regions of high water content, green to red areas show regions with low water content. The plant root is overlaid on the image in black. Scale bar (bottom left corner), 2 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig16large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Application examples
Figure 17 relates quantitative root traits from image analysis with aboveground measurements.
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig17.jpg" /> 
Figure 17: Typical application examples for root data. 
(A) and (B) show root information used for aboveground-belowground plant characterization in a phenotyping context. (A) represents root growth from the sugar beet cultivar Ferrara, (B) compares six rhizobox grown sugar beet cultivars using leaf-to-root area ratio (data from one replicate). (C) and (D) are functional relations between traits as found in plant physiological research. (C) shows the influence of leaf-to-root area ratio on dry matter production and (D) the relation of root surface area to stomata conductance. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig17large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Figure 17A and 17B are relevant for phenotyping focusing on comprehensive aboveground and belowground plant characterization. Figure 17A shows root growth of sugar beet cultivar Ferrara (cf. Figure 8 for images). Expansion of the root system indicates the capacity of a cultivar to explore the soil volume in a given time span of the vegetation period. Figure 17B shows leaf-to-root surface area ratio of six sugar beet cultivars, providing a descriptor for the balance between plant supply (root) and demand (leaf).
Figures 17C and 17D give examples for functional relations of interest in physiological research. In Figure 17C leaf-to-root surface area ratio is related to dry matter formed during the experiment, indicating the predominant role of the assimilating surface as a limiting factor for dry matter accumulation. The lack of significance in spite of a comparatively high R2 is related to the low number of paired data (n=6) used here. Figure 17D reveals that cultivars with higher root surface area (improved uptake) have an average higher stomata conductance over the course of the experiment. The higher root area apparently sustains water extraction, thereby prolonging stomata opening.

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RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

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