Name: rgb and spectral root imaging for plant phenotyping and physiological research: experimental setup and imaging protocols
Uploaded: 2017-08-08T15:00:00
Duration: 11 min 37 s
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लेखक ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष FWF परियोजना संख्या P 25190-B16 (सूखे प्रतिरोध की जड़ें) के माध्यम से धन स्वीकार करते हैं। Hyperspectral इमेजिंग मूल संरचना की स् थापना आर्थिक रूप से संघीय सरकार के निचले ऑस्ट्रिया (भूमि Niederösterreich) परियोजना K3-F-282/001-2012 के माध्यम से द्वारा समर्थित किया गया। चीनी चुकंदर प्रयोग AGRANA अनुसंधान से प्राप्त किया गया था के लिए अतिरिक्त धन &#38; नवाचार केंद्र GmbH (ARIC)। लेखक क्रेग जैक्सन प्रयोग और पांडुलिपि के अंग्रेजी सुधार के दौरान तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद। हम भी Markus Freudhofmaier जो स्थापना RGB इमेजिंग सेटअप करने के लिए योगदान दिया और जोसेफ Schodl rhizobox बढ़ते के निर्माण के लिए स्वीकार करते हैं।

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

प्रोटोकॉल जड़ प्रणाली इमेजिंग हो गई मिट्टी के लिए दो पूरक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। विश्वसनीय प्रयोगात्मक परिणामों के लिए एक महत्वपूर्ण कदम एक भी और सजातीय सब्सट्रेट परत अवलोकन विंडो पर तंग रूट-मिट्टी संपर्क प्रदान करते हैं और हवा से बचने के लिए सामने शीशे पर सुनिश्चित करने के लिए है rhizoboxes के भरने है। यह अपेक्षाकृत ठीक छनी मिट्टी का उपयोग करने के लिए मुख्य कारण है &#60; 2 मिमी: बड़ा समुच्चय समुच्चय के बीच रिक्तियों के साथ अवलोकन विंडो पर उच्च सतह आकारिकी में परिणाम। रूट युक्ति निर्जलीकरण के एक उच्च जोखिम के अलावा, यह भी अधिक जटिल छवि प्रसंस्करण तकनीकों पानी मैपिंग31के लिए की आवश्यकता है।
प्रोटोकॉल के संशोधन इसलिए बेहतर और जल्दी rhizoboxes के भरने पर ध्यान केंद्रित। वर्तमान में समय को भरने के बारे में 30 मिनट प्रति बॉक्स है। इसके अलावा दो कांच खिड़कियों के साथ rhizoboxes का उपयोग दोनों पक्षों और रोशनी एकरूपता बेहतर आरजीबी छवियों के लिए ऑप्टिमाइज़ करने के लिए संशोधन से इमेजिंग के लिए परीक्षण कर रहे हैं। हार्डवेयर विस्तार भी एकीकरण के रूप में अच्छी तरह से rhizobox सिस्टम में33 इमेजिंग समाई planar optodes32 पर विचार हो सकता है। यह हालांकि वर्तमान उन्नयन गतिविधियों से परे है।
सॉफ्टवेयर संशोधन ऊपर फ्यूज और RBG छवियों34नीचे करने के लिए स्वचालित छवि पंजीकरण पर ध्यान केंद्रित। Hyperspectral के लिए इमेजिंग उन्नत unsupervised सुविधा निष्कर्षण28 के रूप में अच्छी तरह से और अधिक संवेदनशील पर्यवेक्षित लक्ष्य पता लगाने के तरीकों के SVMs35 परीक्षण कर रहे हैं के रूप में दृष्टिकोण। जिससे hyperspectral डेटा संभावित रूप से एकाधिक मिट्टी, rhizosphere और रूट गुण36के आकलन के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा यह एक (अर्ध) विकसित करने के लिए लक्षित है और साथ ही वास्तुकला लक्षण (शाखाओं में बंटी आवृत्ति कोण शाखाओं में बंटी,) automatized मोर्फोलिजिकल मात्रा ठहराना करने के लिए रूट सिस्टम विश्लेषक37 का एक संशोधित संस्करण पर आधारित rhizobox रूट छवियों (लंबाई, व्यास, सतह) के लिए सॉफ्टवेयर।
मुख्य सीमा के लिए 3 डी इमेजिंग दृष्टिकोण की तुलना में प्रोटोकॉल की सतह दिखाई जड़ और rhizosphere गुण के लिए प्रतिबंध है। हालांकि यह दिखा दिया है कि दृश्यमान रूट लक्षण21पूरी जड़ प्रणाली के लिए एक विश्वसनीय प्रॉक्सी कर रहे हैं। Rhizobox तकनीक आसानी से पारंपरिक विनाशकारी नमूना (कुल रूट सिस्टम लक्षण बनाम दृश्यमान के संबंध को मान्य करने के लिए गतिशील विकास इमेजिंग के अंत में धोने) के साथ संयुक्त है। इस संबंध के बीच प्रजाति21अलग-अलग हो सकता है के रूप में, विनाशकारी नमूने दिखाई लक्षण के लिए एक अलग फसल प्रजातियों के साथ किसी भी नए phenotyping श्रृंखला से विश्वसनीय अनुमान को सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यथार्थवादी बढ़ती शर्तों (मिट्टी), अस्थायी हल RGB इमेजिंग और hyperspectral इमेजिंग से chemometric रूट और rhizosphere डेटा के माध्यम से रूट कार्यक्षमता (जैसे पानी तेज) पर निष्कर्ष के लिए अपेक्षाकृत उच्च क्षमता throughput के संयोजन है। जिससे विधियों उच्च throughput अंकुर और गैर-मिट्टी जड़ यह आंशिक रूप से कार्यात्मक प्रक्रियाओं में गहरी phenotyping अंतर्दृष्टि कम प्रयोगात्मक जटिलता और उन्नत 3 डी विधि-15की तुलना में उच्च throughput के साथ की अनुमति देता है, जबकि तरीकों14, इमेजिंग में निष्कर्ष प्रतिबंध पर काबू पा।
आगामी प्रयोगों में प्रोटोकॉल के मैकोरायझिया रूट प्रणाली के विकास और मृदा संरचना, नाइट्रोजन और कार्बन के संबंध में आवरण फसल प्रजातियों की phenotyping जड़ विशेषताओं के रूप में रूप में अच्छी तरह से फलियां की कार्यक्षमता पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाएगा साइकल चलाना।

जड़ों के भंडारण जैसे पौधों के लिए कई आवश्यक कार्य प्रदान assimilates, स्थलीय पौधों में मिट्टी, और तेज के लंगरवानी और1पानी और पोषक तत्वों के परिवहन। एक विकासवादी नज़रिये से, जड़ अक्षों के गठन भूमि पौधों2की उत्पत्ति के लिए एक मौलिक पूर्व शर्त माना जाता है। इस महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद, ऐतिहासिक जड़ों जैविक अनुसंधान में केवल एक सीमांत स्थिति पर कब्जा कर लिया है। और हाल के समय में, तथापि, वहाँ चित्र 1में इसका सबूत के रूप में संयंत्र रूट प्रणाली में वैज्ञानिक रुचि बढ़ रही है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig1.jpg"> 
चित्रा 1: पादप जीव विज्ञान में मूल अध्ययन की प्रासंगिकता। रूट की संख्या सभी विज्ञान पत्रिकाओं में प्रकाशित संयंत्र अध्ययन के एक प्रतिशत के रूप में पिछले दशकों से संबंधित अध्ययन। खोज कीवर्ड "संयंत्र" और "संयंत्र और रूट" का उपयोग कर Scopus से परिणाम। <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
दो मुख्य कारणों से रूट अनुसंधान में हाल ही में अग्रिम आबाद hypothesized किया जा कर सकते हैं। पहला, स्थलीय वनस्पति वैश्विक परिवर्तन3के परिणामस्वरूप और अधिक पर्यावरण तनाव को उजागर है। कृषि फसल उत्पादन के संदर्भ में यह अनुमान है कि दुनिया भर में लगभग 30% कृषि क्षेत्र का पानी और फास्फोरस4द्वारा,5सीमित हैं। फसल पैदावार के तनाव में कमी एक मुख्य कारण है कि दुनिया भर में बारिशों के कृषि-पारिस्थितिक6के लिए संभावित उत्पादन क्षमता कम 50% में अनुमान कर रहे हैं महत्वपूर्ण लब्धि के लिए कर रहे हैं। कम संसाधनों की उपलब्धता के अलावा, यह भी गरीब संसाधन के उपयोग दक्षता,7उपलब्ध संसाधनों का दोहन करने के लिए एक संयंत्र की यानी अपर्याप्त क्षमता करने के लिए संबंधित है। नाइट्रेट जो नकारात्मक अन्य पारिस्थितिकी प्रणालियों को प्रभावित कर सकते हैं जैसे मोबाइल संसाधनों के नुकसान में यह परिणाम है। वर्तमान वैश्विक नाइट्रोजन उपयोग दक्षता का उदाहरण के लिए 47%8बजे अनुमान है। बेहतर संसाधन का उपयोग बेहतर प्रबंधन विधियों के माध्यम से दक्षता और खेती है इसलिए दोनों के लिए उच्च महत्व के निरंतर विकास के लिए पर्यावरणीय स्थिरता के रूप में रूप में अच्छी तरह से कृषि outputs के। इस संदर्भ संयंत्र में जड़ें सुधार फसलों और फसल प्रणालियों9,10के लिए एक प्रमुख लक्ष्य माने जाते हैं।
पौधे की जड़ों में हाल ही में रुचि के लिए एक दूसरा महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि माप तरीकों में प्रौद्योगिकीय अग्रिम है। रूट विधियों द्वारा दो प्रमुख चुनौतियों का सामना लंबे समय तक प्रतिबंधित किया गया है: वे था ज्यादातर11, धोने से मात्रा का ठहराव के लिए अलग किया जा करने के लिए मिट्टी में बढ़ रही पौधों से जड़ों की माप के लिए जिससे जड़ अक्षों की वास्तु व्यवस्था परेशान। खुदाई का उपयोग कर स्वस्थानी रूट अवलोकन जिससे प्राकृतिक स्थान में मिट्टी, जड़ों के संरक्षण के तरीके, वानस्पतिक विवरण12के लिए इस्तेमाल किया गया है। अभी भी वे बहुत समय लेने वाली हैं और इस प्रकार तुलनात्मक संरचनात्मक-कार्यात्मक जड़ प्रणाली विश्लेषण की थ्रूपुट आवश्यकताओं को पूरा नहीं करते। दूसरी ओर रूट वास्तुकला माप के लिए उच्च-थ्रूपुट तरीके ज्यादातर कृत्रिम मीडिया पर और अंकुर पौधों13 के लिए जहां पौधों का प्राकृतिक विकास के वातावरण को एक्सट्रपलेशन संदिग्ध14किया जाता है थे।
मूल अनुसंधान के हाल ही में बूम कसकर विधियों15इमेजिंग में अग्रिम करने के लिए जुड़ा हुआ है। इमेजिंग दृष्टिकोण रूट अध्ययनों में मोटे तौर पर तीन प्रकार में बांटा जा सकता है। पहली बार उच्च संकल्प सीटी और एमआरआई16जैसे 3D विधियाँ हैं। जाइलम अन्त: शल्यता17सूखे प्रेरित के रूप में इन तरीकों मिट्टी, के साथ पौधे की जड़ों की बातचीत प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं। आम तौर पर वे अपेक्षाकृत छोटे नमूने जहां वे विस्तृत टिप्पणियों की अनुमति दें करने के लिए लागू होते हैं। अलग आकार के बर्तन और ठीक रूट इमेजिंग के लिए सीटी और एमआरआई की तुलना में18प्रदान की जाती है। दूसरा, वहाँ उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग पद्धतियों19,20कर रहे हैं। जहां उच्च कन्ट्रास्ट जड़ों और पृष्ठभूमि के बीच अपेक्षाकृत सरल विच्छेदन की अनुमति देता है ज्यादातर के आधार पर आम 2D RGB इमेजिंग कृत्रिम मीडिया (जेल, अंकुरण पेपर) पर बढ़ती जड़ों के ये तरीके हैं। वे उच्च throughput अंकुर जड़ लक्षण मानकीकृत कृत्रिम बढ़ती शर्तों13के तहत विभिन्न फसल जीनोटाइप्स के बीच तुलना के लिए उपयुक्त हैं। इन दो दृष्टिकोणों के बीच में rhizobox तरीके हैं: वे लंबी समय अवधि के दौरान मिट्टी में बढ़ती जड़ों के 2D इमेजिंग का उपयोग और मध्यम थ्रूपुट21,22है। (2D) रूट इमेजिंग के लिए एक हाल ही में चुनौती भी संरचना23का वर्णन के अलावा रूट कार्यक्षमता के संकेतकों पर कब्जा करने के लिए है।
वर्तमान समाचार पत्र में हम रूट (i) एक सस्ता और आसान कस्टम-आरजीबी इमेजिंग सेटअप और (ii) एक अधिक जटिल NIR इमेजिंग सेटअप का उपयोग कर सिस्टम हो गए rhizobox इमेजिंग के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल मौजूद है। इन दो setups से प्राप्त उदाहरण परिणाम दिखाए गए हैं और phenotyping संयंत्र और संयंत्र शारीरिक अनुसंधान के संदर्भ में चर्चा की।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rhizobox</td>
			<td>Technisches B&#252;ro f&#252;r Bodenkultur</td>
			<td>Experimental builder</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Lamps ATUM HORTI 600</td>
			<td>Klutronic</td>
			<td>AHI10600F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent light tube HiLite T5 Day</td>
			<td>Juwel Aquarium</td>
			<td>86324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV light tube Eurolite 45cm slim 15 W</td>
			<td>Conrad</td>
			<td>593384 - 62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canon EOS 6D</td>
			<td>Canon Austria GmbH</td>
			<td>8035B024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32</td>
			<td>Adobe Systems Software Ireland Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinRhizo Pro v. 2013</td>
			<td>Regent Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xeva-1.7-320 SWIR camera</td>
			<td>Xenics</td>
			<td>XEN-000105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrograph Imspector N25E</td>
			<td>Specim</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperspectral imaging scanner</td>
			<td>Carinthian Tech Research AG</td>
			<td>Experimental builder</td>
			<td>Design and assemblage of Hyperspectral Imaging Scanner and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab R2106a</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Including Toolboxes for Image Processing, Signal Processing and Statistics and Machine Learning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP4 Poromoeter</td>
			<td>Delta-T-Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-3100C Area Meter</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASF Styradur polystyrene sheets</td>
			<td>Obi Baumarkt</td>
			<td>9706318</td>
			<td>Different types of polystyrene sheets or other material separating differently moistured soil can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rgb and spectral root imaging for plant phenotyping and physiological research: experimental setup and imaging protocols

संयंत्र रूट गतिशीलता की बेहतर समझ कृषि प्रणालियों की संसाधन के उपयोग दक्षता में सुधार और पर्यावरणीय तनावों के खिलाफ फसल किस्मों के प्रतिरोध में वृद्धि करने के लिए आवश्यक है। एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल RGB और hyperspectral इमेजिंग जड़ प्रणाली के लिए प्रस्तुत किया है। दृष्टिकोण rhizoboxes जहां पौधों में प्राकृतिक मिट्टी पूरी तरह से विकसित रूट सिस्टम का निरीक्षण करने के लिए एक लंबे समय के साथ विकसित का उपयोग करता है। प्रयोगात्मक सेटिंग्स पानी तनाव में rhizobox पौधे का आकलन करने और जड़ों की भूमिका का अध्ययन के लिए उदाहरण हैं। एक RGB इमेजिंग सेटअप समय पर जड़ विकास के सस्ते और जल्दी मात्रा का ठहराव के लिए वर्णन किया गया है। Hyperspectral इमेजिंग रूट विभाजन के लिए RGB रंग आधारित thresholding की तुलना में मिट्टी पृष्ठभूमि से सुधारता है। Hyperspectral इमेजिंग की विशेष शक्ति कार्यात्मक समझने के लिए रूट-मिट्टी सिस्टम पर chemometric जानकारी के अधिग्रहण है। यह उच्च संकल्प पानी सामग्री मानचित्रण के साथ प्रदर्शन किया है। स्पेक्ट्रल इमेजिंग हालांकि छवि प्राप्ति, प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए आरजीबी दृष्टिकोण की तुलना में अधिक जटिल है। दोनों तरीकों का एक संयोजन है जड़ प्रणाली की एक व्यापक मूल्यांकन ऑप्टिमाइज़ कर सकते हैं। आवेदन के उदाहरण रूट और aboveground लक्षण को एकीकृत संयंत्र phenotyping और संयंत्र शारीरिक अनुसंधान के संदर्भ के लिए दिया जाता है। रूट इमेजिंग के आगे सुधार RGB छवि गुणवत्ता बेहतर रोशनी विभिन्न प्रकाश स्रोतों का उपयोग कर के साथ अनुकूलन और एक्सटेंशन रूट ज़ोन गुण वर्णक्रमीय डेटा से पर अनुमान करने के लिए छवि विश्लेषण विधियों के द्वारा प्राप्त किया जा सकता।

Example results are presented for root segmentation based on RGB and HS imaging. For spectral imaging an example of high resolution water mapping is provided. Finally results are shown that demonstrate the scientific context where image based root data are applied.
RGB based root measurement
Figure 8 shows an RGB root image time series of sugar beet cultivar Ferrara. The images reveal some artefacts from inhomogeneous illumination of the rhizoboxes, with brighter areas along the left side and different brightness at the overlapping area between top and bottom images.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig8.jpg" /> 
Figure 8: Root growth time series from the RGB imaging. 
Pictures show the sugar beet cultivar Ferrara at different days after sowing (DAS). The images show some artefacts due to non-homogeneous illumination at the left side of the image and between top and bottom images. Scale bars, 2 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig8large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Figure 9 provides details on root segmentation based on color thresholding for cultivar Ferrara at day after sowing (DAS) 35. As a reference (Figure 9A), a binary image is used where all roots were manually tracked with a Graphic Tablet. The time required for manual tracking of the entire, fully developed, dense sugar beet root system was around four hours. Figure 9B gives a detailed view on a selected area at the top of the image where old lateral roots are present. Here several root axes are not classified by the color threshold. At the bottom (Figure 9C) on the contrary, where white young roots are predominant, the color based segmentation properly classifies all root axes. The binarized root system (Figure 9D) shows a black area at the left side from the illumination artefact which was defined as exclusion region before running quantitative analysis. Figure 9E shows the corresponding pixel histograms of selected features (roots vs. soil) for the red channel of the RGB image from Ferrara at DAS 35. The root pixels (blue color) clearly show three peaks corresponding to bright young laterals, dark old laterals and tap root. The overlap between the old laterals and the soil background is very strong, leading to unclassified root axes (cf. Figure 9B).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig9.jpg" /> 
Figure 9: Root segmentation using a color threshold. 
(A) Manually segmented root system using a Graphic Tablet, (B) area with poorly segmented old root axes in the top and (C) properly segmented young axes in the bottom of the image, and (D) binary image obtained from color based thresholding. (E) Pixel histograms for selected features of the RGB image. Roots are represented by the blue bars with different root types indicated; soil is represented by the red bars. Scale bars in A and D, 2 cm; scale bars in B and C, 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig9large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The resulting total visible root length quantified for the manually segmented reference image is 1534.1 cm, while the automatized, color based segmentation gives a total root length of 1427.6 cm.
Greyscale images from UV-illumination do not provide an advantage in the case shown here and performed worse compared to color thresholding (root length: 1679.7 cm). Old roots could not be segmented, and there was more noise in the image, probably due to lower light intensity of the UV lamps. However, in case of young roots with high auto-fluorescence and a bright background substrate, UV-illumination can still be an option as shown by an image obtained from another experiment where sand was used as background substrate (Figure 10).
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig10.jpg" /> 
Figure 10: UV illumination to visualize roots on bright background. 
Example from a durum wheat root system growing in a rhizobox filled with quartz sand. The rhizobox is imaged with illumination for (A) UV light and (B) fluorescent (day) light. Scale bars, 2 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig10large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
HSI based root measurements
Figure 11 provides the mean spectra for three root ROIs (old and young lateral, tap root) and two soil ROIs (top and bottom of rhizobox).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig11.jpg" /> 
Figure 11: Mean spectra of root and soil. 
Spectra from regions of interest (ROIs) on the root (three root types) and in the soil (top and bottom of the rhizobox). The ROIs are selected to determine an optimum segmentation criterion between root and soil. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig11large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
It is evident that the tap and young lateral roots differ substantially from the background in intensity of most spectral bands. For the old laterals the intensity differences are much lower. A feature that can be inferred visually is the different slope of the spectrum around water absorption region (1450 nm). Here the slope of root spectra is higher compared to soil spectra. Furthermore a change of tap and young lateral spectra in the region around 1100 nm can be identified that does not occur in the old laterals.
Figure 12A shows the result from the search algorithm identifying a spectral ratio with strongest foreground-background contrast. The ratio of spectra at 1476 nm to 1076 nm provides the best separation between roots and soil. The resulting histogram of root foreground and soil background pixels is shown in Figure 12B. Although there is some overlap, most pixels are clearly separated from the soil background. Fitting a bimodal Gaussian curve through the histogram and using Bhattacharyya distance for quantification, a value of 7.80 is obtained. A value higher 3.0 indicates strong image contrast allowing reliable separation28.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig12.jpg" /> 
Figure 12: Difference in reflectance between root foreground and soil background for different spectral band ratios and pixel histogram at spectral ratio used for segmentation. 
(A) Bright colors (yellow) show high contrast between foreground and background, dark colors (blue) show low contrast. The first 15 bands have been removed because of noise. The red lines indicate the band ratio with highest contrast. (B) Pixel histogram of roots (blue) and soil (red) at segmentation spectral ratio. Blue bars represent the root and red bars the soil. The intensity value corresponds to the ratio of spectral band 160 to spectral band 49. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig12large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The binary image (Figure 13) is created by applying a global intensity threshold of the identified spectral ratio at a value of 1.008 calculated from the histogram distance27. Analysis of root length of this image gives a total length of 1557.3 cm which represents an error of only 1.5% compared to the manually tracked reference image.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig13.jpg" /> 
Figure 13: Binary image of the root system of sugar beet cultivar Ferrara. 
The image is obtained by applying a global spectral threshold. Scale bar (bottom left corner), 2 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig13large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Although root segmentation has improved using spectral information compared to color based information, the main intention of HS imaging is analysis of chemometric image properties. This is exemplified via mapping the water content of a rhizobox image.
Figure 14A shows the mean spectra of the compartments in the calibration rhizobox (cf. Figure 7) filled with soil of different water content. The shape of spectra is similar between the compartments, i.e. here a spectral ratio does not necessarily provide a more stable classification criterion. Thus intensity at a single spectral band (1680 nm), where the average difference between adjacent water contents is maximized, is identified as best separating criterion. The resulting pixel histograms for this spectral wavelength are shown in Figure 14B.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig14.jpg" /> 
Figure 14: Spectral features for water content calibration. 
(A) Mean spectra of nine water compartments from the calibration rhizobox with different water contents; (B) Pixel histograms for the water compartments at band 216 where average distance between neighboring compartment is maximum. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig14large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The relation of the average pixel intensity at 1680 nm and the measured water content is shown in Figure 15.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig15.jpg" /> 
Figure 15: Relation of spectral reflectance and volumetric water content. 
The figure shows data pairs of measured water content and spectral reflectance with empirical curves (linear and exponential) fit to the data excluding the highest water contents (red triangles). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig15large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Differentiation of higher water contents from spectral intensity becomes difficult. A significant regression (either linear or exponential) with high R2 can be fit to water contents up to around 0.30 cm3 cm-3. Wetter soil conditions cannot be reliably predicted by the intensity value. Similar behavior of an exponential relation between reflectivity and water content with a decreasing response to water contents higher 0.30 cm3 cm-3 was also found in other studies30.
A rhizobox image with fine mapping of water content is shown in Figure 16. Four aspects have to be remarked. First, a region of lower water content can be seen in the rooted parts of the rhizobox. Second, strongest depletion is concentrated in the vicinity to single root axes. Third, depletion zones also occur where no root axes are visible on the surface, indicating regions where roots are hidden in soil. Fourth, water mapping without further image-processing results in a patchy appearance due to the aggregated soil. This can indicate inhomogeneous water content distribution at the aggregate scale, but also surface morphology effect on image quality. Chemometric image-processing techniques are an option to overcome such morphological effects in spectral images31, but are not implemented so far in the Matlab scripts used here.
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig16.jpg" /> 
Figure 16: Water content mapping on a rhizobox. 
The dark blue colours represent regions of high water content, green to red areas show regions with low water content. The plant root is overlaid on the image in black. Scale bar (bottom left corner), 2 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig16large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Application examples
Figure 17 relates quantitative root traits from image analysis with aboveground measurements.
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig17.jpg" /> 
Figure 17: Typical application examples for root data. 
(A) and (B) show root information used for aboveground-belowground plant characterization in a phenotyping context. (A) represents root growth from the sugar beet cultivar Ferrara, (B) compares six rhizobox grown sugar beet cultivars using leaf-to-root area ratio (data from one replicate). (C) and (D) are functional relations between traits as found in plant physiological research. (C) shows the influence of leaf-to-root area ratio on dry matter production and (D) the relation of root surface area to stomata conductance. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig17large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Figure 17A and 17B are relevant for phenotyping focusing on comprehensive aboveground and belowground plant characterization. Figure 17A shows root growth of sugar beet cultivar Ferrara (cf. Figure 8 for images). Expansion of the root system indicates the capacity of a cultivar to explore the soil volume in a given time span of the vegetation period. Figure 17B shows leaf-to-root surface area ratio of six sugar beet cultivars, providing a descriptor for the balance between plant supply (root) and demand (leaf).
Figures 17C and 17D give examples for functional relations of interest in physiological research. In Figure 17C leaf-to-root surface area ratio is related to dry matter formed during the experiment, indicating the predominant role of the assimilating surface as a limiting factor for dry matter accumulation. The lack of significance in spite of a comparatively high R2 is related to the low number of paired data (n=6) used here. Figure 17D reveals that cultivars with higher root surface area (improved uptake) have an average higher stomata conductance over the course of the experiment. The higher root area apparently sustains water extraction, thereby prolonging stomata opening.

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