Name: preparation of chitosan-based injectable hydrogels and its application in 3d cell culture
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00
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この研究は国立科学財団の中国 (21474057 および 21604076) によって支えられました。

警告: 使用前に関連するすべての材料安全データ用紙 (MSDS) を参照してください。ヒューム フードと保護具 (保護メガネ、保護手袋、白衣、等) の使用を含む化学実験を行う際は、適切な安全対策を使用してください。プロトコル標準セル処理テクニック (殺菌、細胞回復、細胞継、細胞凍結、細胞染色、等) が必要です。
 1 準備のヒドロゲル <ol><li><ol><li><o...

<ol>
	<li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+biomedical+applications.">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li><li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications.">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-mediated+Formation+and+Patterning+of+Hydrogels+for+Cell+Culture+Applications.">Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications.</a> J. Vis. Exp. (115), (2016).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).</li><li>Breslin, S., O&#8217;Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilely+prepared+inexpensive+and+biocompatible+self-healing+hydrogel:+a+new+injectable+cell+therapy+carrier.">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).</li><li>Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+multiresponsive+and+dynamic+chitosan-based+hydrogels+for+controlled+release+of+bioactive+molecules.">Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).</li><li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+injectable+hydrogel+formed+by+in+situ+cross-linking+of+glycol+chitosan+and+multi-benzaldehyde+functionalized+PEG+analogues+for+cartilage+tissue+engineering.">An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).</li><li>Ding, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+and+self-crosslinked+polysaccharide+hydrogel+with+autonomous+self-healing+ability.">A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability.</a> Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+gels+based+on+constitutional+dynamic+chemistry+and+their+potential+applications.">Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel.">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li><li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Injectable,+Self&#8208;Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System.">An Injectable, Self&#8208;Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li><li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials.">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+Tumor+Chemotherapy+Effect+by+Using+an+Injectable+Self-healing+Hydrogel+as+Drug+Carrier.">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+magnetic+self-healing+hydrogel.">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+an+injectable,+self-healable+and+dual+responsive+hydrogel+for+drug+delivery+and+3D+cell+cultivation.">Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation.</a> Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).</li><li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate.">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).</li><li>Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue.">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells.">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li><li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells.">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li></ol>

このプロトコル (図 1) で発表したハイドロゲルは 2 つの主要なコンポーネント: 天然高分子グリコール キトサンおよび合成ベンズアルデヒド終了高分子ゲル化剤 DF ペグ、両方の生体適合性材料であります。DF ペグの合成は、ワンステップ改質反応を使用して提示されます。分子量 4,000 のペグは、溶解度、変更効率、ハイドロゲルの剛性の問題でこのプロトコルに選ば?...

ヒドロゲルは大量の水と柔らかい物性を架橋高分子材料と彼らは多くの生物医学応用1,2で使用されています。ゲルは、生体内で細胞の生理学的環境に非常に類似している柔らかく、ぬれた環境を提供できます。したがって、ヒドロゲルは 3 D 細胞培養3,4の最も人気のある足場になっています。2D ペトリ皿培養に比べると、3 D 細胞培養細胞外マトリックス (ECM) 模倣し、増殖・分化のための5のための組み立てる細胞の微小環境を提供する迅速に進んでいます。さらに、天然高分子を含むゲルは、細胞が増殖し、3を区別するための生体適合性と促進環境を提供できます。由来の合成高分子ヒドロゲルは動物由来タンパク質またはウイルスのような複雑な影響を排除する、そのシンプルかつ明確なコンポーネントに適しています。3 D 細胞培養のためのすべてのハイドロゲル候補では、中でゲルが容易に作製し、一貫性のあるプロパティを持つが常に優先されます。異なる研究要件に合わせてハイドロゲルのプロパティを調整する施設は、よく6として重要です。
3 D 細胞培養7のための汎用性の高いハイドロゲル プラットフォームとなる動的なイミン化学を使用してリコール キトサンによるハイドロゲルの安易な準備をご紹介します。このメソッドでは、よく知られているバイオ セーフティー リコール キトサンを使用ヒドロゲルのネットワークのフレームを確立します。そのアミノ基は、ヒドロゲル8crosslinkages として動的なイミン結合を形成する高分子ゲル化剤として終了ベンズアルデヒド ポリエチレングと反応しました。動的なイミン結合を形成し、機械的に調節可能な架橋ネットワーク9,10,11ヒドロゲルを endowing 周囲に可逆的かつ responsively を分解します。高含水、生体適合材料と調節可能な機械的強度のため、ハイドロゲルが正常に 3 D 細胞培養12,13L929 細胞の足場として適用されます。ここのプロトコルは、高分子ゲル化剤合成、ハイドロゲルの準備、セルの埋め込み、3 D 細胞培養など、手順を詳しく説明します。
ヒドロゲルはまたその動的なイミンの crosslinkages、その多様々 なバイオ刺激(酸/pH、ビタミン B6 誘導体ピリドキサール、タンパク質パパイン等)への応答を含む、ヒドロゲルへことができることを示すための他のいくつかの機能を示しています8生理学的条件下で分解を誘導しました。ヒドロゲルはまた自己 healable と注射、ヒドロゲル最小限の侵襲的な注入法で投与できる薬剤と細胞の配達14,15では優位します。ヒドロゲルは磁気、温度、pH 応答性など16,17を満たすことができるような特定のプロパティを獲得する互換性のある機能性添加剤や特定のあらかじめデザインされた高分子ゲル化剤を追加することによって、幅広い研究要件。これらのプロパティでは、注射をするハイドロゲルの潜在的な能力薬の細胞in vitroとin vivoの生物医学研究とアプリケーションの両方で複数のキャリアを明らかにします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1151">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Glycol chitosan</td>
			<td style="width:360px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:131px;">39280-86-9</td>
			<td style="width:385px;">90% degree of deacetylation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Carboxybenzaldehyde</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>619-66-9</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N, N&#39;-dicyclohexylcarbodiimide</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>538-75-0</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride anhydrous</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-dimethylamiopryidine</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>1122-58</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyethyleneglycol</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>5254-43-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>109-99-9</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Toluene</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>108-88-3</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl ether</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>60-29-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anhydrous CaCl2</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>596-09-8</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25535-16-4</td>
			<td>94%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI-1640 culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td>0.01 M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin streptomycin solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td></td>
			<td>AR-G2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>710-3channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L929 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Evaporator</td>
			<td>EYELA</td>
			<td></td>
			<td>N-1100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 guage needle</td>
			<td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>48-guage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM3000 B</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope software</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat gun</td>
			<td>Confu</td>
			<td></td>
			<td>KF-5843&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of chitosan-based injectable hydrogels and its application in 3d cell culture

プロトコルは、動的イミン化学を用いたキトサン ベースのゲルを準備する安易な効率的、かつ汎用性の高い手法を提案します。終了合成ベンズアルデヒド高分子ゲル化剤とグリコール キトサンの溶液を混合することによって、ハイドロゲルを用意し、ヒドロゲルは室温で数分間で効率的に得られます。グリコール キトサン、高分子ゲル化剤、含水量の様々 な比率によって異なるゲル化時間と剛性の多彩なゲルが得られます。破損して、その外観と係数、crosslinkages として動的なイミン結合の可逆性ヒドロゲルを回復できます。この自己 healable プロパティにより、注入処理後整数一括ハイドロゲルに絞りの部分から自己治癒があるので注射するハイドロゲルです。ヒドロゲルも多動的イミン結合の別の平衡状態のため多くの生物活性の刺激に応答するものです。このハイドロゲルが生体適合性として確認された、L929 マウス線維芽細胞が埋め込まれた次の標準的な手順と細胞の増殖は簡単に 3 D 細胞培養プロセスによって評価されました。ヒドロゲルは細胞のための 3 D 環境の生理学的な模倣は利益を得た別の研究のための調節可能なプラットフォームを提供できます。そのマルチ応答性、自己 healable と注射のプロパティと共に、ヒドロゲルは薬と将来の生物医学アプリケーションのセルに複数のキャリアとして可能性があります適用できます。

ゲルの調製とその 3 D 細胞培養上でこのプロトコルの図式は、図 1で提供しています。ハイドロゲルの内容と異なる機械的強さの準備率の情報は表 1のとおりです。ヒドロゲルの自己 healable とレオロジー特性図2 周波数テスト対貯蔵弾性率によるハイドロゲルの剛性をプレゼントします。細胞の共焦点画像とヒドロゲルの文化の日と携?...

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Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

ここで動的イミン化学を用いたキトサン ベース注射ゲルの作製について述べる。ハイドロゲルの機械的強度と 3 D 細胞培養への応用を調整する方法が掲載されています。

キトサンを用いた注射ゲルおよび 3 D 細胞培養への応用の準備

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

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