Name: preparation of chitosan-based injectable hydrogels and its application in 3d cell culture
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por la nacional Science Foundation de China (21474057 y 21604076).

PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Utilice prácticas de seguridad apropiadas cuando se realizan experimentos de química, incluyendo el uso de una campana y equipo de protección personal (gafas, guantes, bata de laboratorio, etc.). El protocolo requiere célula estándar de manejo de técnicas (esterilización, recuperación de la célula, célula pases, congelación de células, tinción de células, etc.).
 1. p...

<ol>
	<li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+biomedical+applications.">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li><li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications.">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Sawicki, L. 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Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilely+prepared+inexpensive+and+biocompatible+self-healing+hydrogel:+a+new+injectable+cell+therapy+carrier.">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).</li><li>Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+multiresponsive+and+dynamic+chitosan-based+hydrogels+for+controlled+release+of+bioactive+molecules.">Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).</li><li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+injectable+hydrogel+formed+by+in+situ+cross-linking+of+glycol+chitosan+and+multi-benzaldehyde+functionalized+PEG+analogues+for+cartilage+tissue+engineering.">An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).</li><li>Ding, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+and+self-crosslinked+polysaccharide+hydrogel+with+autonomous+self-healing+ability.">A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability.</a> Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+gels+based+on+constitutional+dynamic+chemistry+and+their+potential+applications.">Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel.">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li><li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Injectable,+Self&#8208;Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System.">An Injectable, Self&#8208;Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li><li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials.">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+Tumor+Chemotherapy+Effect+by+Using+an+Injectable+Self-healing+Hydrogel+as+Drug+Carrier.">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+magnetic+self-healing+hydrogel.">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+an+injectable,+self-healable+and+dual+responsive+hydrogel+for+drug+delivery+and+3D+cell+cultivation.">Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation.</a> Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).</li><li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate.">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).</li><li>Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue.">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells.">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li><li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells.">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li></ol>

El hidrogel en este protocolo (figura 1) tiene dos componentes principales: el quitosano de glicol polímero natural y una sintética benzaldehído terminaron gelator polímero DF PEG, que son ambos materiales biocompatibles. Síntesis de DF PEG se presentan mediante una reacción de modificación de un solo paso. PEG de peso molecular 4.000 fue elegida en el presente Protocolo en preocupaciones de solubilidad, eficacia de la modificación, así como rigidez de hidrogel. Una serie de hidroge...

Los hidrogeles son materiales de polímero reticulado con grandes cantidades de agua y propiedades mecánicas, suaves, y se han utilizado en muchas aplicaciones biomédicas1,2. Los hidrogeles pueden ofrecer un ambiente suave y húmedo, que es muy similar al entorno fisiológico de las células en vivo. Por lo tanto, los hidrogeles se han convertido en uno de los más populares andamios para celular 3D cultura3,4. Comparado con el cultivo celular 2D de Petri, cultivo celular 3D ha avanzado rápidamente para ofrecer que una matriz extracelular (ECM) mímico el microambiente de las células en contacto con y ensamblar para propósitos de proliferación y diferenciación5. Además, los hidrogeles que contienen polímeros naturales podrían ofrecer ambientes bio-compatibles y promover para que las células proliferan y diferencian3. Hidrogeles derivados de polímeros sintéticos se prefieren para sus componentes simples y claras, que excluye influencias complejas como las proteínas de origen animal o virus. Entre todos los candidatos de hidrogel para el cultivo celular 3D, siempre se prefieren los hidrogeles que fácilmente están preparados y tienen una propiedad constante. La facilidad para ajustar propiedades de hidrogel para adaptarse a requisitos de la investigación es importante como bien6.
Aquí presentamos una fácil preparación de un hidrogel de glicol basados en quitosano utilizando química dinámica imina, que se convierte en una plataforma versátil de hidrogel para celular 3D cultura7. En este método, bien conocido de bio-compatibles de glicol quitosano se utilizan para establecer los marcos de las redes de hidrogel. Sus grupos aminos se reaccionaron con un polietilenglicol benzaldehído terminada como el gelator de polímero para formar la imina dinámica bonos como crosslinkages de hidrogeles8. Bonos de imina dinámica pueden formar y descomponer reversible y sensiblemente al entorno, dotando los hidrogeles con reticulado mecánicamente ajustable redes9,10,11. Debido a su contenido alto de agua, materiales bio-compatibles y fuerzas mecánicas ajustables, el hidrogel se aplica con éxito como un andamio para la elución de L929 células en 3D de la célula cultura12,13. El protocolo aquí detalles de los procedimientos, incluyendo la síntesis del polímero gelator hidrogel preparación, incrustación de célula y cultivo celular 3D.
El hidrogel también muestra varias otras características debido a su crosslinkages imina dinámico, incluyendo su múltiples sensibles a varios estímulos de bio (ácido/pH, piridoxal derivado de la vitamina B6, la papaína de la proteína, etc.), indicando que podría ser el hidrogel inducida que se descomponen bajo condiciones fisiológicas8. El hidrogel es también uno mismo-healable e inyectables, que significa el hidrogel podría ser administrado a través de un método de inyección invasiva mínima y obtener una ventaja en drogas y celulares entregas14,15. Mediante la adición de aditivos funcionales o gelators del polímero específico prediseñado, el hidrogel es compatible para obtener propiedades específicas como magnético, temperatura, pH de receptivo, etc.16,17, que podría satisfacer un amplia gama de necesidades de investigación. Esas propiedades revelan capacidad potencial de hidrogel que un inyectable múltiples portadores de drogas y células en investigación bio-médica en vitro y en vivo y aplicaciones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1151">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Glycol chitosan</td>
			<td style="width:360px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:131px;">39280-86-9</td>
			<td style="width:385px;">90% degree of deacetylation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Carboxybenzaldehyde</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>619-66-9</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N, N&#39;-dicyclohexylcarbodiimide</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>538-75-0</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride anhydrous</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-dimethylamiopryidine</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>1122-58</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyethyleneglycol</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>5254-43-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>109-99-9</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Toluene</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>108-88-3</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl ether</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>60-29-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anhydrous CaCl2</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>596-09-8</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25535-16-4</td>
			<td>94%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI-1640 culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td>0.01 M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin streptomycin solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td></td>
			<td>AR-G2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>710-3channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L929 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Evaporator</td>
			<td>EYELA</td>
			<td></td>
			<td>N-1100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 guage needle</td>
			<td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>48-guage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM3000 B</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope software</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat gun</td>
			<td>Confu</td>
			<td></td>
			<td>KF-5843&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of chitosan-based injectable hydrogels and its application in 3d cell culture

El protocolo presenta un método fácil, eficaz y versátil para preparar Hidrogeles basados en chitosán usando química dinámica imina. El hidrogel se prepara mezclando soluciones de glicol quitosano con un gelator de polímero sintetizado benzaldehído terminado y eficientemente se obtienen hidrogeles en varios minutos a temperatura ambiente. Por relaciones diferentes entre glicol quitosano, gelator de polímero y el contenido de agua, se obtienen hidrogeles versátiles con tiempos de congelación diferentes y rigidez. Cuando está dañada, el hidrogel puede recuperar sus apariciones y el módulo, debido a la reversibilidad de los bonos de imina dinámicos como crosslinkages. Esta propiedad la healable permite el hidrogel que inyectable puesto que puede ser auto curado de piezas exprimidas a un hidrogel a granel integral después del proceso de inyección. El hidrogel es también múltiple sensible a muchos estímulos bioactivos debido a Estados de equilibrio diferentes de los bonos de imina dinámico. Este hidrogel fue confirmado como bio-compatibles y células de fibroblasto de ratón de elución de L929 fueron integrados siguientes procedimientos estándar y fácilmente se evaluó la proliferación celular por un proceso de cultivo celular 3D. El hidrogel puede ofrecer una plataforma ajustable para diferentes investigaciones donde es beneficiado un imitador fisiológico de un entorno 3D para las células. Junto con sus propiedades múltiples de respuesta, uno mismo-healable e inyectables, los hidrogeles pueden aplicarse potencialmente como portadores de múltiples drogas y células en futuras aplicaciones de bio-médica.

Una presentación esquemática de este protocolo en la preparación del hidrogel y su uso como cultivo celular 3D se ofrece en la figura 1. Información de contenidos y relaciones con diversas fuerzas mecánicas el hidrogel se resume en la tabla 1. El hidrogel de uno mismo-healable y propiedad de reología presenta rigidez de hidrogel por módulo de almacenamiento versus frecuencia de prueba en la figura 2. Las imágenes confocales celular y nú...

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Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Aquí describimos una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano utilizando química dinámica imina. Se presentan métodos para ajustar la fuerza mecánica de hidrogel y su aplicación en cultivos celulares 3D.

Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

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