Name: in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00
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Questo lavoro è supportato da ricerche di NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), Grant di ricerca istituzionali (RN), Start-up concedere (RN) e seme di MD Anderson CIC concedere (RN).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. preparazione del Peptide per il vaccino
<ol><li>Sciogliere il peptide liofilizzato con tampone fosfato salino (PBS) alla concentrazione appropriata e vortexare per 30 s. Nota: Per hgp10025–33, la concentrazione finale è 1 mg/mL e per OVA257–264, la concentrazion...

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates.">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets.">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627 (2014).</li><li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li><li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8(+)+T+cell+sequestration,+dysfunction+and+deletion.">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8++T+cells.">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li><li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects.">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li><li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy.">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

Mentre questo protocollo è molto semplice, ci sono pochi passaggi critici che devono essere eseguite con cautela. L'innesco di covax dopo l'iniezione della cellula-T antigene-specifiche in fase di test è necessario vedere qualsiasi uccisione degli obiettivi pulsati. Mentre è possibile che la vaccinazione di base acqua covax crea uno stato infiammatorio acuto, per la fase infiammatoria cronica, sostituendo la formulazione a base di acqua di breve durata con un approccio basato su olio di antigene lento rilascio può pr...

Protocolli multipli esistono per valutare il potenziale citolitica (CTL) di un CD8+ o CD4+ T-cellula. Questa valutazione può essere facilmente fatto in vitro sotto condizioni controllate1,2,3. Inoltre, modelli di malattia infettiva, come LCMV, classicamente hanno esaminato la funzione CTL attraverso l'uso di differenzialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) etichettati cellule bersaglio dove il CFSECiao-sono cellule con etichettate ha pulsato con un peptide e CFSElo-pulsati cellule rimangono contrassegnati dell'obiettivo. Le cellule sono poi iniettate con un rapporto 1:1 e valutate per la perdita della CFSECiao-etichettato pulsati obiettivi di flusso cytometry4. Modelli di vaccino e rifiuto hanno utilizzato anche strategie simili per valutazione di in vivo uccidendo entrambi CD8+ e CD4+ T cellule così come cellule NK5,6. Questo è un potente, ma richiede l'uso di agenti infettivi che innescano il sistema immunitario prima dell'iniezione di destinazione.
Questo protocollo, d'altra parte, non richiede nessuna infezione priore dell'host e invece utilizza una strategia di vaccinazione per primo il sistema immunitario prima dell'iniezione di destinazione. Questa vaccinazione è composto da una formulazione a base di acqua di vaccino del peptide che richiede la fornitura di un immunostimolante cocktail chiamato covax7, costituito da un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonistico l'anticorpo e l'interleuchina 2 (il-2) che conduce alla combinazione sinergica di immunostimulatory agenti per l'ottenimento dei peptidi specifici adescamento e risposta immunitaria robusta. Come tale, questo test fornisce una rapida lettura della funzione CTL come il vaccino è somministrato insieme con le cellule per la valutazione della funzione solo tre giorni prima dell'iniezione delle cellule bersaglio. Inoltre, l'innesco di covax è abbastanza forte che si può vedere la capacità di uccisione della cellula T antigene-specifiche innescata tra 4 e 24 h dopo l'iniezione.
La limitazione principale di questo protocollo è l'identificazione della timeline in vivo per la rilevazione dell'uccisione di destinazione che è opportuno sia l'antigene e l'ipotesi da testare. Attenta valutazione deve essere effettuata, come variazioni nella forza di antigene così come le alterazioni genetiche in cellule di T in fase di test potrebbe causare funzione differenziale di CTL che richiederebbe un rilevamento di tempi diversi di uccisione di destinazione. Inoltre, mentre la concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per melanoma umano antigene glicopeptide 100 (hgp10025-33) e ovoalbumina257-264 (OVA257-264)8,9 , uso di un altro modello di antigene che può essere più appropriato per un dato studio richiederebbe ulteriore convalida. A causa delle differenze attese nella capacità degli antigeni di un obiettivo di stimolare la CTL effettrici funzione in combinazione con il covax come adiuvante, ottimizzazione della frequenza di concentrazione e dose dose IL-2 può essere essenziale per raggiungere l'obiettivo desiderato. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.

<table style="border-collapse:collapse;width:523pt" width="697">
	<colgroup>
		<col style="width:199pt" width="265" />
		<col style="width:110pt" width="146" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">6- to 12-week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:110pt" width="146">Charles River</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">027</td>
			<td style="width:125pt" width="167">C57 Black 6 mice</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">OT-1 6-12-week old female mice&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Jackson Labs</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">hgp10025&#8211;33&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">834139</td>
			<td>KVPRNQDWL</td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">OVA 257&#8211;264&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">MISC-012</td>
			<td>SIINFEKL</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">Imiquimod cream 5%&#160;</td>
			<td class="xl69">Fougera</td>
			<td class="xl73">51672-4145-6</td>
			<td>Aldara Cream</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">CD40-specific mAb&#160;</td>
			<td class="xl69">BioXcell</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">BE0016-2</td>
			<td>clone FGK4.5</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">rhIL-2 protein&#160;</td>
			<td class="xl69">Hoffman LaRoche Inc</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">136</td>
			<td>Recombinant human IL-2 protein</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">70% isopropyl alcohol Prep&#160;</td>
			<td class="xl69">Kendall</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">S-17474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">PBS</td>
			<td class="xl69">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010-023</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">FBS</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140-079</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RBC lysis buffer&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A10492-01</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RPMI 1640 Media</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">L-Glutamine&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Pen/Strep</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">CFSE</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">C34554</td>
			<td>5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Sigma&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1.5 mL MCT graduated natural&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">05-408-129</td>
			<td>microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">70% ethanol</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl73">BP8201500</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Trypan blue solution, 0.4%&#160;&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Hemocytometer</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">27 gauge needle</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1 mL syringe</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model

Metodologie attuali per l'uccisione di antigene-specifiche sono limitate per uso in vitro o utilizzati in modelli di malattie infettive. Tuttavia, c'è non un protocollo specificamente destinato a misurare antigene-specifiche uccisione senza un'infezione. Questo protocollo è stato progettato e descrive i metodi per superare queste limitazioni, consentendo per la rilevazione dell'antigene-specifiche uccidendo una cella obiettivo di CD8+ T cells in vivo. Ciò avviene mediante l'Unione di un modello di vaccinazione con un tradizionale CFSE-etichetta target uccidendo il dosaggio. Questa combinazione consente al ricercatore di valutare il potenziale CTL di antigene-specifiche direttamente e velocemente come il dosaggio non è dipendente della crescita del tumore o infezione. Inoltre, la lettura si basa sulla citometria a flusso e quindi dovrebbe essere facilmente accessibile alla maggior parte dei ricercatori. La limitazione principale dello studio consiste nell'identificare la timeline in vivo che è appropriato per l'ipotesi in fase di test. Variazioni nella forza di antigene e mutazioni nelle cellule T che possono derivare in funzione citolitica differenziale devono essere attentamente valutati per determinare il momento ottimale per la raccolta delle cellule e valutazione. La concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per hgp10025-33 e OVA257-264, ma occorrerebbero ulteriori convalida per altri peptidi che potrebbero essere più appropriati per un determinato studio. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.

Prima dell'iniezione delle cellule bersaglio CFSE-etichetta, la miscela di 1:1 cella viene eseguita su un citometro a flusso per determinare le frequenze di base il CFSECiao sia CFSElo destinazione delle cellule. Figura 1 A Mostra la strategia di gating per rilevare i cambiamenti nelle popolazioni CFSE, un cancello iniziale viene effettuato utilizzando parametri FSC e SSC. Le cellule di CFSE-positive totale sono quindi s...

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In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

L'obiettivo del presente protocollo è quello di consentire il rilevamento in vivo di uccisione di una cella di destinazione in un modello murino di antigene-specifiche.

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

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Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

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