Name: in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model at JoVE.com

이 작품은 NIH 연구에 의해 지원 (A1R03AI120027 (RN)와 1R21AI20012 (RN)), 제도적 연구 그랜트 (RN), 시작 (RN) 부여, 그리고 MD 앤더슨 CIC 시드 부여 (RN).

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 텍사스 대학 MD 앤더슨 암 센터의에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 백신에 대 한 펩 티 드의 준비
<ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 적절 한 농도와 30에 대 한 소용돌이와 동결 건조 된 펩 티 드를 분해 s. 참고: hgp10025-33, 최종 농도 1 mg/mL 및 OVA257-264, 최종 ?...

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates.">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets.">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627 (2014).</li><li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li><li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8(+)+T+cell+sequestration,+dysfunction+and+deletion.">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8++T+cells.">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li><li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects.">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li><li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy.">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

이 프로토콜은 간단 하 고, 신중 하 게 수행 해야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 다음 테스트 되 고 항 원 특정 T 세포의 주입 covax 못쓰게 펄스 목표의 모든 살인을 볼 필요가 있다. 물 기반 covax 예방 접종 급성 염증 상태, 만성 염증 성 단계에 대 한 만듭니다 수 있지만 더 나은 생산할 수 있습니다 느린 원 출시 석유 기반의 접근 방식으로 단기 물에 기초를 둔 배합을 대체 결과<sup class="xref"...

CD8의 cytolytic (CTL) 잠재력을 평가 하기 위해 존재 하는 여러 프로토콜+ 또는 CD4+ T-셀. 이 평가 생체 외에서 제어 조건1,,23에서 쉽게 할 수 있습니다. 또한, 전염병 모델, LCMV, 고전적인 차동 CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르) 대상 셀을 표시를 사용 하 여 CTL 기능 검사 어디는 CFSE안녕-레이블이 지정 된 셀 펩 티 드 및 CFSElo펄스-레이블이 대상 셀 남아 있다 unpulsed. 셀에 1:1 비율로 주입은 그리고는 CFSE안녕의 손실에 대 한 평가-흐름 cytometry4펄스 대상 이라고 표시 된. 백신 및 제거 모델도 비슷한 전략에 vivo에서 두 CD8 살해의 평가 대 한 사용+ 와 CD4+ T 세포 뿐만 아니라 NK 세포5,6. 이 강력한 분석 결과 이지만 대상 주입 전에 면역 시스템 프라임 전염 성 요원의 사용을 요구 한다.
이 프로토콜을 다른 한편으로, 아무 사전 감염 호스트의를 요구 하 고 대신 예방 접종 전략 대상 주입 전에 면역 체계를 이용 한다. 이 예방 접종 이라고 covax7, 수용 체 통행세 같이 7 (TLR7)의 구성 된 immunostimulatory 칵테일의 제공을 요구 하는 펩타이드 백신의 물 배합의 구성 주 작동 근 (imiquimod 크림), agonistic 안티-CD40 항 체, 그리고 interleukin-2 (일리노이-2) 펩 티 드 관련 못쓰게 하 고 강력한 면역 반응의 도출에 대 한 immunostimulatory 에이전트의 시너지 조합에 지도. 따라서,이 분석 결과 제공 CTL 함수의 빠른 판독 백신 3 일전 주입 대상 셀의 함수의 평가 대 한 셀에 함께 관리 된다. 또한, covax 못쓰게가 강하다 충분히 주입 후 4와 24 h 사이 끝났다 항 원 특정 T 세포의 살해 능력을 볼 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 항 원 및 가설 테스트에 적합 한 대상 살인의 탐지를 위한 식별 됩니다. 주의 깊은 평가 수행 해야 합니다, 유전 변경 뿐 아니라 항 원 강도에 유사로 T-세포에서 테스트 되 고 될 수 있습니다 대상 살인의 다른 타이밍 검출 필요로 하는 차동 CTL 함수. 또한, 예방 접종에 맞게 최적화 된 인간 흑색 종 항 원 glycopeptide 100 (hgp10025-33)에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 동안 ovalbumin (OVA257-264)257-264 8,9 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 항 원 모델의 사용 추가 유효성 검사가 필요한 것 이다. 예상된 한 보조로는 covax와 함께에서 CTL effector 기능을 자극 하는 대상 항 용량 차이, 때문에 일리노이-2 복용량 농도 및 복용량 주파수의 최적화는 원하는 목표를 달성 하기 위해 필수적인 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.

<table style="border-collapse:collapse;width:523pt" width="697">
	<colgroup>
		<col style="width:199pt" width="265" />
		<col style="width:110pt" width="146" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">6- to 12-week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:110pt" width="146">Charles River</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">027</td>
			<td style="width:125pt" width="167">C57 Black 6 mice</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">OT-1 6-12-week old female mice&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Jackson Labs</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">hgp10025&#8211;33&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">834139</td>
			<td>KVPRNQDWL</td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">OVA 257&#8211;264&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">MISC-012</td>
			<td>SIINFEKL</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">Imiquimod cream 5%&#160;</td>
			<td class="xl69">Fougera</td>
			<td class="xl73">51672-4145-6</td>
			<td>Aldara Cream</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">CD40-specific mAb&#160;</td>
			<td class="xl69">BioXcell</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">BE0016-2</td>
			<td>clone FGK4.5</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">rhIL-2 protein&#160;</td>
			<td class="xl69">Hoffman LaRoche Inc</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">136</td>
			<td>Recombinant human IL-2 protein</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">70% isopropyl alcohol Prep&#160;</td>
			<td class="xl69">Kendall</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">S-17474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">PBS</td>
			<td class="xl69">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010-023</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">FBS</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140-079</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RBC lysis buffer&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A10492-01</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RPMI 1640 Media</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">L-Glutamine&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Pen/Strep</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">CFSE</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">C34554</td>
			<td>5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Sigma&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1.5 mL MCT graduated natural&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">05-408-129</td>
			<td>microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">70% ethanol</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl73">BP8201500</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Trypan blue solution, 0.4%&#160;&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Hemocytometer</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">27 gauge needle</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1 mL syringe</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model

항 원 특정 살인에 대 한 현재 방법은 생체 외에서 사용을 제한 또는 전염병 모델에 활용. 그러나, 감염 없이 항 원 특정 살인을 측정 하기 위한 프로토콜이 아니라 있다. 이 프로토콜은 설계 및 항 원 특정의 검출 함으로써 이러한 한계를 극복 하는 방법을 설명 합니다+ T vivo에서세포 CD8 하 여 목표 셀의 살인. 이 분석 결과 죽이고 전통적인 CFSE 표시 대상 접종 모델을 병합 하 여 수행 됩니다. 이 조합은 분석 결과 감염 또는 종양의 성장에 따라 의존 하지 않습니다 직접 그리고 신속 하 게 항 원 특정 CTL 잠재력을 평가 하는 연구원을 수 있습니다. 또한, 판독 cytometry에 기반 하 고 그래서 대부분 연구자에 게 쉽게 접근할 수 있어야. 연구의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 테스트 중인 가설에 적합 한 식별 됩니다. 항 원 강도 변화와 차동 cytolytic 함수에서 발생할 수 있는 T 세포에 돌연변이 세포 수확 및 평가 대 한 최적의 시간을 결정을 신중 하 게 평가 해야 합니다. 예방 접종에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 맞게 최적화 된 hgp10025-33 , OVA257-264, 하지만 추가 유효성 검사는 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 펩 티 드에 대 한 필요할. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.

CFSE 표시 대상 셀의 주입, 전에 1:1 셀 혼합 CFSE안녕 와 CFSE소호 대상 셀의 기준 주파수를 결정 하는 흐름 cytometer에서 실행 됩니다. 그림 1 A CFSE 인구에 있는 변화를 검출 하는 제어 전략, 초기 게이트 FSC 그리고 SSC 매개 변수를 사용 하 여 이루어집니다. 이 인구는 레이블 없는 생 splenocytes에 비해 상대적으로 작은 총 CFSE 긍?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model at JoVE.com

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

The overall goal of this experiment is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model. This method can help answer questions in immunology field, such as sufficiency and detection of antigen-specific cytolytic killing of target cells in an attacked immune system and how this could be modified by manipulation of the T-cells to enhance the function in vivo. The main advantage of this technique is that it allows the researcher to assess antigen-specific cytolytic potential directly and quickly, as the assay is not depend on tumor growth or infection.Presenting this procedures will be Cara Haymaker, and Yared Hailemichael to instruct us from Department of Melanoma Medical Oncology. After anesthetizing mice, according to the text protocol, use 70%isopropyl alcohol to spray the tail base area for injection. Using a 27 gauge needle attached to a syringe, and with the bevel side facing up, penetrate four to five millimeters into the tail base region and inject 100 microliters of previously prepared peptide solution.Then, lateral to the vaccine injection site, inject 100 microliters of anti-CD4D antibody. Carefully apply 50 milligrams per mouse of imiquimod cream on the vaccination sites. Rub the cream into the surface until the cream is no longer visible and is fully absorbed.Then inject 100 microliters of 100, 000 IUs per milliliter of recombinant human rhIL-2 protein intraperitoneally, in the lower abdominal region. After isolating splenocytes from mice and lysing the red blood cells, according to the text protocol, carry out peptide-pulsing by first resuspending cells at 10 to the sixth cells per milliliter in complete medium. Divide the cells into two 15 milliliter conical tubes and label them as pulsed or unpulsed.For OVA 257 to 264 pulsing, add one microgram per milliliter of peptide to the tube labeled pulsed. Then incubate pulsed and unpulsed cells at 37 degrees Celsius for one hour. Add 10 milliliters of complete medium to both the pulsed and unpulsed tubes to wash the target cells.Then spin the remaining cells at 475 x g and room temperature, for five minutes, before aspirating the supernatent. Prepare a CSFE high-labeling medium by adding 1 microliter per milliliter of CSFE to RPMI 1640 with 2%FBS, for a final concentration of five micromolar per millimeter. Then prepare CSFE low-labeling medium by adding one microliter per milliliter of CSFE to RPMI 1640 with 2%FBS, for a final concentration of 0.5 micromolar per milliliter.To label the target splenolytes, resuspend 10 to the sixth cells per milliliter of pulsed cells with prepared CSFE high-labeling medium, and 10 to the sixth cells per milliliter of unpulsed cells with CSFE low-labeling medium. Mix the cell suspensions by gentle inversion or swirling. Then incubate the cells at 37 degress Celsius for 15 minutes, remixing the cells every five minutes.Next, add 10 milliliters of complete medium to each cell suspension, and centrifuge the cells at 475 x g and room temperature for five minutes. Then aspirate the supernatent and use 10 milliliters of cold PBS to resuspend the cells. Spin the cells at 475 x g and 4 degrees Celsius for five minutes, before repeating the PBS wash.Count the cells and mix peptide-pulsed CSFE high-labeled with unpulsed CSFE low-labeled cells at a 1:1 ratio for injection into recipient mice. Keep an aliquot of one times 10 to the sixth mixed cells to use for a baseline flow cytometry assessment. After injecting and reisolating target cells, according to the text protocol, perform assessment of CTL activity using a standard flow cytometry protocol, acquiring cells using the FITC channel with a 488 nanometer laser for excitation.Prior to injection of CSFE-labeled target cells, the 1:1 cell mixture was run on a flow cytometer to determine the baseline frequencies of both the CSFE high and CSFE low target cells. Shown here is the gating strategy to detect changes in the CSFE populations. An initial gate was made using FSC and SSC parameters.The total CSFE positive cells were then subgated, prior to assessing changes in frequency, as this population is relatively small when compared to the unlabeled endogenous spenlocytes. An example of the relative frequency of the CSFE populations prior to injection is shown here and should be close to one to one. The necessity of the covex priming is seen in this panel, where no killing of the antigen-pulsed CSFE high-target cells was observed at 24 hours post-injection.This figure demonstrates the effective killing of the antigen-pulsed CSFE high-labeled target cells, as the peak that was observed prior to injection was almost undetected, and the ratio was dramatically shifted from 50%to 1%detection. Finally, the figure also shows the kinetics of antigen-pulsed CSFE high-label target cell killing by assessing loss of this population at both 6 and 24 hours post-injection. Once mastered, this technique can be performed in two to three days, depending upon antigen and T-cell function.While attempting this procedure, it is important to remember that CSFE labeling must be uniform, and the kinetics of CTL response must be assessed, prior to performing the assay. Following this procedure, other methods like ELISA, ELISPOT, and intracellular flow cytometry staining can also be performed to assess changes in effector function and answering other additional questions. After watching this video you should be able to have a good understanding of how to assess in vivo CTL function in the absence of an infection or tumor.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

항원 특정 VIVO에서</emCFSE 라벨 대상 세포를 사용하여> 죽이는 분석

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...