Name: a method to assess fc-mediated effector functions induced by influenza hemagglutinin specific antibodies
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00
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इस परियोजना के राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग, CEIRS अनुबंध P01AI097092-04S1 (P.E.L.) के तहत संस्थानों से संघीय धन के साथ भाग में वित्त पोषित किया गया है ।

इस पांडुलिपि में बताए गए प्रयोगों का पालन Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन की संस्थागत आचार संहिता और विनियमों के तहत किया गया.
1. अभिकर्मक या संक्रमण के माध्यम से इंफ्लूएंजा वायरस Hemagglutinin की अभिव्यक्ति
<p class=...

<ol>
	<li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses.">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li><li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM++memory+B+cells.">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942 (2008).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses.">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li><li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li><li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin.">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li><li>Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+solution+to+group+2+influenza+virus+neutralization.">A common solution to group 2 influenza virus neutralization.</a> PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).</li><li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses.">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li><li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin.">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , (2014).</li><li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen.">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li><li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Microbiology+and+Infection.">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li><li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches.">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95 (2016).</li><li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain.">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice.">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li><li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins:+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes.">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li><li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection.">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li><li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection.">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578 (2016).</li><li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc&#947;R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo.">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require Fc&#947;R interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li><li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection.">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li><li>Potter, C. W., Oxford, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+immunity+to+influenza+infection+in+man.">Determinants of immunity to influenza infection in man.</a> Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).</li><li>Memoli, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Antihemagglutinin+and+Antineuraminidase+Antibodies+as+Correlates+of+Protection+in+an+Influenza+A/H1N1+Virus+Healthy+Human+Challenge+Model.">Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model.</a> mBio. 7 (2), e00417 (2016).</li><li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-associated+cross-reactive+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+toward+2009+pandemic+influenza+A+virus+subtype+H1N1.">Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1.</a> J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).</li><li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-Reactive+Influenza-Specific+Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity+Antibodies+in+the+Absence+of+Neutralizing+Antibodies.">Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies.</a> J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).</li><li>Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+activation+of+Fc-mediated+effector+functions+by+influenza+virus+hemagglutinin+antibodies+requires+two+points+of+contact.">Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact.</a> PNAS. , 201613225 (2016).</li><li>Benjamin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Broadly+Neutralizing+Human+Monoclonal+Antibody+Directed+against+a+Novel+Conserved+Epitope+on+the+Influenza+Virus+H3+Hemagglutinin+Globular+Head.">A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head.</a> J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).</li><li>Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-neutralization+of+influenza+A+viruses+mediated+by+a+single+antibody+loop.">Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop.</a> Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).</li><li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly+Neutralizing+Anti-Influenza+Virus+Antibodies:+Enhancement+of+Neutralizing+Potency+in+Polyclonal+Mixtures+and+IgA+Backbones.">Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones.</a> J Virol. 89 (7), 3610 (2015).</li><li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine.">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li><li>Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+cytotoxicity+to+influenza+virus-infected+cells.+II.+Requirement+for+antibody+and+non-T+lymphocytes.">Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes.</a> J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).</li><li>Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fc&#947;+receptors.">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fc&#947; receptors.</a> J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li><li>de Vries, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus-specific+antibody+dependent+cellular+cytoxicity+induced+by+vaccination+or+natural+infection.">Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection.</a> Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen,+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies.">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).</li></ol>

यहां वर्णित विधि उपयोगकर्ता murine FcγRIV संलग्न करने के लिए एक हा विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की क्षमता को मापने के लिए अनुमति देता है । लक्ष्य प्रतिजन, इंफ्लूएंजा वायरस hemagglutinin, वायरस या प्लाज्मिड डीएनए के अभ?...

प्रतिरक्षा मौसमी इंफ्लूएंजा वैक्सीन द्वारा प्रदान की परंपरागत रूप से hemagglutination निषेध (हाय) परख1है, जो एंटीबॉडी की उपस्थिति है कि hemagglutinin के रिसेप्टर बाइंडिंग साइट लक्ष्य द्वारा मूल्यांकन किया गया है । ये उच्च सक्रिय एंटीबॉडी प्रतिरक्षा नसबंदी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन आम तौर पर सुरक्षा के अपने चौड़ाई में संकीर्ण कर रहे हैं, केवल एक का चयन कुछ उपभेदों के लिए प्रतिरक्षा प्रदान इंफ्लूएंजा वायरस । अलगाव और मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लक्षण वर्णन है कि hemagglutinin पहचान (हा) एक सार्वभौमिक इंफ्लूएंजा वैक्सीन के विकास का सुझाव है पहुंच के भीतर2,3,4, 5 , ६ , 7 , 8. एक सार्वभौमिक इंफ्लूएंजा वैक्सीन के प्रमुख उद्देश्य से एक को इंफ्लूएंजा वायरस9,10,11,12 के संरक्षित क्षेत्रों की ओर एक मजबूत एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्रेरित है , 13 , 14 , 15 , 16. मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी कि इन संरक्षित epitopes पहचान, दोनों बेअसर और गैर बेअसर एंटीबॉडी17,18, के लिए एफसी-FcγR बातचीत की आवश्यकता के लिए इष्टतम दिखाया गया है vivo में संरक्षण और एफसी के योगदान को उजागर प्रतिरक्षा19,20वायरस को समग्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए प्रतिरोधक क्षमता ।
संरक्षण के संबद्ध संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा का आकलन करने में महत्वपूर्ण हैं । इन मैट्रिक्स वैज्ञानिकों और चिकित्सकों टीकों की प्रभावकारिता का अनुमान है, डेटा का महत्व है, और उपचार के पाठ्यक्रम की अनुमति देते हैं । केवल स्थापित इंफ्लूएंजा वायरस संक्रमण के खिलाफ संरक्षण के सहसंबंधी hemagglutination अवरोध परख है । 1:40 की एक titer बीमारी के जोखिम में एक ५०% की कमी के साथ जुड़ा हुआ है1,21 -और एंटीबॉडी की उपस्थिति है कि रिसेप्टर बंधन हा के गोलाकार सिर पर स्थित साइट को लक्षित करने से समूहन को बाधित दर्शाता है. हालांकि, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि टी सेल प्रतिक्रियाओं एक बेहतर बुजुर्गों में इंफ्लूएंजा वायरस के संक्रमण के खिलाफ संरक्षण के सहसंबंधी हो सकता है । दिलचस्प है, हाल की एक रिपोर्ट से पता चलता है कि neuraminidase अवरोध गतिविधि प्रतिरक्षा का एक बेहतर कारक हो सकता है22इंफ्लूएंजा के लिए । सौभाग्य से, इस तरह के बेअसर या neuraminidase अवरोध परख के रूप में इन विट्रो परख में विशिष्ट उपाय कर सकते है हा डंठल या neuraminidase-विशिष्ट एंटीबॉडी । इन विट्रो परख में पारंपरिक के अधिकांश, तथापि, केवल खाते में एंटीबॉडी के प्रतिजन बंधन क्षेत्र के समारोह में ले और एफसी क्षेत्र की भूमिका उपाय नहीं है । इसके अतिरिक्त, गैर के योगदान को बेअसर एंटीबॉडी कि vivo में एफसी रिसेप्टर सगाई के माध्यम से रक्षा17,18का पता नहीं कर रहे हैं. आदेश में एंटीबॉडी कि एफसी मध्यस्थता उन्मुक्ति प्रेरित जैसे एंटीबॉडी निर्भर कोशिका मध्यस्थता cytotoxicity (ADCC), एक मजबूत इन विट्रो परख की जरूरत है द्वारा afforded सुरक्षा को मापने के लिए ।
नीचे वर्णित विधि murine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की क्षमता का आकलन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से संशोधित Jurkat सेल लाइन एक सक्रिय murine प्रकार व्यक्त 1 FcR, FcγRIV के उपयोग के माध्यम से एफसी मध्यस्थता कार्यों प्रेरित । एंटीबॉडी सगाई FcγR transduces intracellular संकेत है कि सक्रिय टी कोशिकाओं के परमाणु कारक-मध्यस्थता luciferase गतिविधि से चलाता है । परख पारंपरिक तकनीक है कि अलगाव और प्राथमिक प्रभाव कोशिकाओं और प्रवाह cytometry के उपयोग की संस्कृति की आवश्यकता पर कई लाभ है एफसी के सक्रियकरण-मध्यस्थता प्रभाव का पता लगाने के लिए कार्य करता है19,23,24 ,25,26. सबसे पहले, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से विभिंन वायरल लक्ष्य, FcγRs, और विभिंन प्रजातियों (मानव और murine) से एंटीबॉडी शामिल अनुकूलित किया जा सकता है । दूसरा, एक संशोधित Jurkat सेल लाइन का उपयोग सक्रिय टी के एक परमाणु कारक के तहत एक luciferase रिपोर्टर जीन के साथ एक FcγR व्यक्त-सेल (NFAT) एक बड़े प्रारूप परख कि आसानी से एक प्लेट luminescence मापने पाठक का उपयोग कर सकते है विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । यहां, प्राथमिक प्रभाव कोशिकाओं के पारंपरिक सक्रियकरण Jurkat सेल की सतह पर एक FcγR के एंटीबॉडी सगाई पर NFAT-luciferase की प्रेरण के साथ बदल दिया है । यह ९६-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप परख triplicates में सात कमजोर पड़ने के साथ चार विभिंन नमूनों के माप के लिए अनुमति देता है-नमूनों की संख्या है कि पारंपरिक तकनीकों का उपयोग कर बोझिल हो सकता है । वहां अतिरिक्त अंक के लिए इस परख कि प्रयोगों के डिजाइन और डेटा की व्याख्या को प्रभावित कर सकते है के साथ विचार कर रहे हैं । वायरल लक्ष्य एंटीबॉडी मांयता के लिए आदेश में सेल सतह पर व्यक्त किया जाना चाहिए । इस को कम करने के लिए, लक्ष्य प्रतिजन (जैसे एक आंतरिक वायरल प्रोटीन) सीधे एक थाली की सतह पर लेपित किया जा सकता है. हालांकि, इस पर अभी तक कड़ाई से जांच नहीं की गई है. साथ ही, संशोधित Jurkat सेल लाइन FcγR को सक्रिय करने का केवल एक प्रकार व्यक्त करता है और किसी भी निरोधात्मक FcγRs व्यक्त नहीं, जबकि प्राथमिक सेल लाइनों एक शारीरिक संदर्भ में सभी रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं ।
हम पहले इस परख का इस्तेमाल किया है प्रदर्शित करने के लिए कि एक polyclonal संदर्भ में epitope विशिष्टता एफसी मध्यस्थ प्रभाव कार्यों को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और कि इष्टतम सक्रियण एंटीबॉडी-निर्भर सेल की मध्यस्थता प्रतिक्रिया के दो बिंदुओं की आवश्यकता है 27,28से संपर्क करें । यहां, हम एक तरीका है कि डंठल विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की क्षमता का आकलन संलग्न करने के लिए और FcγRIV सक्रिय murine सक्रिय का वर्णन । हालांकि वहां अपवाद है29,30, मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी की एक बड़ी संख्या लक्ष्य antigenically hemagglutinin के डंठल क्षेत्र संरक्षित और इस तरह एक सार्वभौमिक इंफ्लूएंजा के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा टीका.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="921">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">A549 cells&#160;</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:184px;">CCL-185</td>
			<td style="width:353px;">Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:184px;">CRL-3216</td>
			<td>Human embryonic kidney cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:184px;">11668019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:184px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">White tissue culture treated 96-well plate</td>
			<td>Corning, Inc.&#160;</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10X MEM</td>
			<td style="width:141px;">Gibco</td>
			<td style="width:184px;">11430-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Jurkat cell expressing murine FcgRIV</td>
			<td style="width:141px;">Promega</td>
			<td style="width:184px;">M1201</td>
			<td>Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Jurkat cell expressing human FcgRIIIa</td>
			<td style="width:141px;">Promega</td>
			<td style="width:184px;">G7010</td>
			<td>Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Jurkat cell expressing human FcgRIIa</td>
			<td style="width:141px;">Promega</td>
			<td style="width:184px;">G9901</td>
			<td>Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luminometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy H1 Multi-Mode reader</td>
			<td>Luminescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Bio-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:141px;">Promega</td>
			<td style="width:184px;">G7940</td>
			<td>Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Madin Darby canine kidney cells</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:184px;">CCL-34</td>
			<td>Canine kidney cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to assess fc-mediated effector functions induced by influenza hemagglutinin specific antibodies

एंटीबॉडी अपने प्रतिजन बाध्यकारी डोमेन और एफसी-क्षेत्रों के माध्यम से वायरल रोगजनकों के खिलाफ सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं युग्मन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यहां, हम वर्णन कैसे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा एफसी प्रभाव के कार्यों के सक्रियकरण को मापने के लिए एक आनुवंशिक इंजीनियर Jurkat सेल लाइन एक सक्रिय प्रकार व्यक्त 1 एफसी-FcγR के उपयोग के साथ इंफ्लूएंजा वायरस hemagglutinin लक्ष्यीकरण । इस विधि का प्रयोग करते हुए विशिष्ट एफसी-FcγR इम्युनोग्लोबुलिन द्वारा प्रदत्त बातचीत का योगदान एक इन विट्रो परख का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है ।

हम प्रदर्शन किया है कि एक डंठल विशिष्ट मॉब, 6F12, लेकिन सिर विशिष्ट एक सिर विशिष्ट मॉब, PY102, CD107a और इंटरफेरॉन γ19को विनियमित द्वारा प्राथमिक प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं को सक्रिय करने में सक्षम था । प्...

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A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

हम एक विधि का वर्णन करने के लिए एफसी के सक्रियकरण को मापने के लिए एंटीबॉडी कि लक्ष्य इंफ्लूएंजा वायरस hemagglutinin द्वारा मध्यस्थ कार्य । यह परख भी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या polyclonal अंय वायरल सतह नच लक्ष्यीकरण के लिए एफसी मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रेरित की क्षमता का आकलन अनुकूलित किया जा सकता है ।

एक विधि एफसी मध्यस्थता प्रभाव इंफ्लूएंजा Hemagglutinin विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा प्रेरित कार्यों का आकलन करने के लिए

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

सभी इन्फ्लुएंजा के मात्रात्मक विश्लेषण सरल स्लॉट ब्लाट Assays में एक वायरल Hemagglutinins और यूनिवर्सल एंटीबॉडी का उपयोग कर Neuraminidases प्रकार

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

इन्फ्लुएंजा वायरस के लिए उच्च throughput जांच विधि

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

इन विट्रो परख में एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी सेल effector समारोह पर immunoregulatory रास्ते के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

इन विट्रो रोगजनक प्रेरित न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन का आकलन करने के लिए कोकल्चर परख

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग उपन्यास H7N9 इन्फ्लूएंजा वायरस से कार्यात्मक संयोजक Hemagglutinin और neuraminidase प्रोटीन की अभिव्यक्ति

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

फ्लो द्वारा A549 कोशिकाओं में लगाव और Internalization इन्फ्लूएंजा के एक वायरस को मापने

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

ढाल centrifugation द्वारा इन्फ्लुएंजा एक वायरस capsids की इन विट्रो disassembly में

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

लागू करने प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) द्वारा प्रेरक translocation क्षमता की जांच करने के लिए<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA मुंह बंद के दौरान

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

प्रतिदीप्ति आधारित neuraminidase निषेध परख विषाणु-विरोधी की neuraminidase अवरोध करनेवाला वर्ग के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

बचने इंफ्लूएंजा वायरस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के भागने के वेरिएंट की पीढ़ी

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...