Name: desensitization and recovery of crayfish photoreceptors upon delivery of a light stimulus
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00
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Diese Arbeit wurde durch dGAPA-UNAM IN224616-RN224616-Zuschuss unterstützt. Die Autoren danken Frau Josefina Bolado, Leiterin der Abteilung für wissenschaftliche Übersetzung von Papieren, aus divisién de Investigacion in facultad de Medicina, UNAM, für die Bearbeitung der englischsprachigen Version dieses Manuskripts.

HINWEIS: Die Experimente entsprechen den Tierschutzgesetzen Mexikos.
1. Versuchsaufbau
<ol><li>Allgemeine Verbindungen<ol>
<li>Schließen Sie den Verstärker über einen Analog-Digital-Wandler an einen geeigneten Computer an und verwenden Sie ein Oszilloskop, um das Experiment zu überwachen (Abbildung 1).</li>
		<li>Verbinden Sie den Photostimulator mit dem konvertierten A/D.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufnahmekammer<ol>
<li>Platzieren Sie die Aufnahmekammer auf ei...

<ol>
	<li>Barriga-Montoya, C., G&#243;mez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pigment+dispersing+hormone+on+the+electrical+activity+of+crayfish+visual+photoreceptors+during+the+24-h+cycle.">Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).</li><li>Barriga-Montoya, C., de la O-Mart&#237;nez, A., Fuentes-Pardo, B., G&#243;mez-Lagunas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desensitization+and+recovery+of+crayfish+photoreceptors.+Dependency+on+circadian+time,+and+pigment-dispersing+hormone.">Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).</li><li>Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+electrophysiological+techniques.">Overview of electrophysiological techniques.</a> Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).</li><li>Brette, R., Destexhe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording.">Intracellular recording.</a> Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).</li><li>Cummins, D., Goldsmith, T. 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Die Krebse haben sich als ausgezeichnetes Modell erwiesen, da sie unter nicht-natürlichen Bedingungen überleben können. Es gibt einen einfachen Zugang zu elektrophysiologischen In-vivo- und In-vitro-Analysen. Darüber hinaus sind Krebstiere eine günstige Gruppe für neurobiologische Forschung auf dem Gebiet der vergleichenden Chronobiologie21.
In diesem Beitrag wird die Untersuchung der Desensibilisierung und Wiederherstellung des lichtaktivierten ...

Um als visueller Reiz wahrgenommen zu werden, muss Licht, das die Augen erreicht, in ein elektrisches Signal umgewandelt werden. Somit löst Licht in allen visuellen Organismen einen Transduktionsionenstrom aus, der wiederum eine Veränderung des Membranpotenzials von Photorezeptorzellen, dem sogenannten Rezeptorpotential, bewirkt. Aus diesem Grund hängt die Lichtempfindlichkeit des Auges in erster Linie vom Zustand der lichtaktivierten Leitfähigkeit ab, die entweder aktiviert oder desensizipiert werden kann.
Bei Krebsphotorezeptoren löst Licht einen langsamen, transienten, ionischen Stromaus 1. Bei der Beleuchtung entsteht der Transduktionsstrom nach einer Verzögerung oder Latenz, bevor er sein Maximum erreicht; danach zerfällt es, da die Transduktionskanäle in einen desensiwordenen Zustand fallen, in dem sie nicht auf weitere Lichtreize reagieren2. Das heißt, Licht, zusätzlich zur Aktivierung der Transduktionsströmung verantwortlich des Sehens, induziert auch eine vorübergehende Dekrementierung der Empfindlichkeit von Photorezeptorzellen. Die Desensizipierung kann einen allgemeinen Schutzmechanismus gegen eine Übermäßige Exposition gegenüber einem angemessenen Stimulus darstellen. Die Lichtempfindlichkeit des Auges wird wiederhergestellt, wenn sich die Transduktionsleitfähigkeit von der Desensibilisierung erholt.
Intrazelluläre Aufzeichnung ist eine nützliche Technik zur Messung der elektrischen Aktivität von erregbaren Zellen3,4,5,6,7,8. Obwohl die intrazelluläre Aufzeichnung mit dem Aufkommen der Patch-Clamp-Technik9seltener geworden ist, ist es immer noch ein bequemer Ansatz, wenn Zellen entweder schwer zu isolieren sind oder eine Geometrie darstellen, die die Bildung der patch-clamping Giga-Dichtungen erschwert(d.h.Dichtungen oder enge Kontakte zwischen der Patchelektrode und Membranen mit elektrischem Widerstand in der Größenordnung von 109Ohm). Beispiele für letztere sind die Spermien10 und die hier untersuchten Photorezeptorzellen. Nach unserer Erfahrung, Procambarus clarkii Photorezeptoren sind schwierig zu isolieren und in der Primärkultur zu halten; Darüber hinaus sind es dünne Stäbe, die die Giga-Siegelbildung schwer zu erreichen machen. In intrazellulären Aufnahmen wird eine scharfe Elektrode in eine Zelle vorgeschoben, die vom umgebenden Gewebe an Ort und Stelle gehalten wird. Die Elektrode wird durch die Hochgeschwindigkeitsschaltschaltung des Verstärkers gehackt, so dass Strom zwischen Spannungsimpulsen abgetastet wird. Dieser Modus wird als diskontinuierliche Single-Elektroden-Spannungsklemme (dSEVC-Modus)11bezeichnet. Der hohe Widerstand (kleine Öffnung) der Elektrode behindert den Diffusionsaustausch zwischen der Zelle und den Pipettenlösungen, was zu einer minimalen Störung des intrazellulären Milieus3führt. Ein möglicher Nachteil dieser Technik ist, dass das Einsetzen von Elektroden einen nicht selektiven Leckstrom erzeugen kann; Daher ist darauf zu achten, dass die Aufzeichnung von Zellen vermieden wird, bei denen die Größe des Leckstroms die vorgesehenen Messungen4,12beeinträchtigen kann.
Dabei verwenden wir isolierte Krebsaugenstiele, um die Desensibilisierung und Wiederherstellung der lichtaktivierten Ionenleitfähigkeit zu bewerten, indem wir intrazelluläre elektrische Aufnahmen von Photorezeptorzellen unter Spannungsklemmenbedingungen durchführen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axoclamp2A&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Axon Instruments Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;">Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digidata 1200 Interface</td>
			<td style="width:129px;">Axon Instruments Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oscilloscope TDS430A</td>
			<td style="width:129px;">Tektronix</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analogic Oscilloscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Photostimulator PS33 Plus</td>
			<td style="width:129px;">Grass</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puller PC-100</td>
			<td style="width:129px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puller P-97</td>
			<td style="width:129px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Capillary Tube Kimax-51</td>
			<td style="width:129px;">Kimble Products</td>
			<td style="width:119px;">34502</td>
			<td>0.8, 1.10, 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HS-2 Headstage</td>
			<td style="width:129px;">Axon Instruments Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Headstage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator MX-4</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Mechanical Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereoscopic Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pClamp</td>
			<td>Axon Instruments Inc</td>
			<td></td>
			<td style="width:180px;">Data acquisition software for digidata 1200 interface</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Clampfit</td>
			<td>Axon Instruments Inc</td>
			<td></td>
			<td style="width:180px;">Analysis software linked to pClamp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Origin</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td style="width:180px;">Data analysis and graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-9333</td>
			<td>Minimum 99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td>Minimum 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td>Minimum 99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hepes</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7523</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S8045</td>
			<td>98.00%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">425044</td>
			<td style="width:180px;">Available chlorine, 10-15%&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

desensitization and recovery of crayfish photoreceptors upon delivery of a light stimulus

Eine Methode zur Untersuchung der Desensibilisierung und Wiederherstellung von Krebsphotorezeptoren wird vorgestellt. Wir führten intrazelluläre elektrische Aufnahmen von Photorezeptorzellen in isolierten Augenstielen mit der diskontinuierlichen Konfiguration der Einzelelektroden-Geschalteten Spannungsklemme durch. Zuerst haben wir mit einer Rasierklinge eine Öffnung in der dorsalen Hornhaut gemacht, um Zugang zur Netzhaut zu erhalten. Danach setzten wir eine Glaselektrode durch die Öffnung ein und drangen in eine Zelle ein, wie durch die Aufzeichnung eines negativen Potentials berichtet. Das Membranpotential wurde auf das Ruhepotential des Photorezeptors eingeklemmt und ein Lichtimpuls angewendet, um Ströme zu aktivieren. Schließlich wurde das zwei Lichtblitzprotokoll verwendet, um die aktuelle Desensibilisierung und Wiederherstellung zu messen. Der erste Lichtblitz löst nach einer Verzögerungsperiode den transduktionsionischen Strom aus, der nach Erreichen einer Spitzenamplitude in einen desensithissiierten Zustand abfällt; der zweite Blitz, der in unterschiedlichen Zeitintervallen angewendet wird, bewertet den Zustand der lichtaktivierten Leitfähigkeit. Um den lichtentwirrten Strom zu charakterisieren, wurden drei Parameter gemessen: 1) Latenz (die Zeit, die zwischen der Lichtblitzabgabe verstrichen ist, und dem Moment, in dem der Strom 10% seines Maximalwerts erreicht); 2) Spitzenstrom; und 3) Desensibilisierungszeitkonstante (exponentielle Zeitkonstante der aktuellen Zerfallsphase). Alle Parameter werden vom ersten Impuls beeinflusst.
Um die Erholung von der Desensibilisierung zu quantifizieren, wurde das Verhältnis p2/p1 im Vergleich zur Zeit zwischen den Impulsen verwendet. p1 ist der Spitzenstrom, der durch den ersten Lichtimpuls evoziert wird, und p2 ist der Spitzenstrom, der vom zweiten Impuls evoziert wird. Diese Daten wurden an eine Summe exponentiver Funktionen angepasst. Schließlich wurden diese Messungen in Abhängigkeit von der zirkadianen Zeit durchgeführt.

Zunächst wird ein repräsentatives Rezeptorpotential von Krebsphotorezeptorzellen erhalten (Abbildung 4). Anschließend wurde ein Testlichtblitz angewendet, um den Lichttransduktionsstrom auszulösen (Abbildung 5). Der kationische Transduktionsstrom1 aktiviert sich nach einer Verzögerung, erreicht ein Maximum und fällt danach langsam in einen absorbierenden desensinationen Zustand, aus dem er sich langs...

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Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

Ein Protokoll zur Untersuchung der Desensibilisierung und Empfindlichkeit sebung von Krebsphotorezeptoren als Funktion der zirkadianen Zeit wird vorgestellt.

Desensitisierung und Wiederherstellung von Krebse Photorezeptoren nach der Lieferung eines leichten Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Diesensibilisierung und Empfindlichkeitsrückgewinnung von Krebsphotorezeptoren als Funktion der zirkadianen Zeit zu untersuchen, wobei interzelluläre elektrische Aufzeichnungen von Photorezeptorzellen in isolierten Augenbeständen verwendet werden, wobei die diskontinuierliche Konfiguration der geschalteten Spannungsspannung mit einer EinzigenElektrode verwendet wird. Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen im neurobiologischen Bereich zu beantworten, wie die zirkadiane Zeitabhängigkeit so vieler elektrophysiologischer Eigenschaften von Photorezeptoren bei Inaktivierung und Genesung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Messung der elektrischen Aktivität von Photorezeptoren ermöglicht.Trotz der Schwierigkeit, Zellen zu isolieren und ohne das intrazelluläre Milieu zu stören. Die Ärzte Carolina Barriga-Montoya und Araceli de la O-Maritnez, Mitarbeiter unseres Labors, demonstrieren dieses Verfahren. Um die intrazelluläre Elektrode vorzubereiten, ziehen Sie das Glaskapillarrohr mit einem Mikropipette-Puller, um eine dünne Spitze mit einer kleinen Öffnung zu erhalten.Als nächstes füllen Sie das gezogene Kapillarglas mit 2,7-molaren Kaliumchlorid-Lösung durch Kapillarität und dann füllen Sie die Hälfte der Pipette mit einer feinen Injektionsnadel. Tippen Sie bei Bedarf auf die Elektrodenpipette, um Luftblasen zu beseitigen. Danach legen Sie die Elektrode auf ihren Halter.Schließen Sie den Halter mit der Verstärkerkopfbühne an den Verstärker an. Danach positionieren Sie die Elektrodenhalter-Kopfstufe mit einem stabilen 3-D-Mikromanipulator. Senken Sie die Elektrode, bis die Badlösung ihre Spitze bedeckt.Wählen Sie den Brückenmodus des Verstärkers aus und messen Sie den Elektrodenwiderstand. Stellen Sie sicher, dass der Widerstand etwa 50 Megaohm beträgt. Null den Offsetstrom und kompensieren kapazitive Transienten über die Haltepositionstaste in der Schnittspannungsklemme des Verstärkers und die Kapazitätsneutralisationstaste im Abschnitt Mikroelektrode 1 des Verstärkers.Um das Superfusionssystem zu konstruieren, gießen Sie die Badlösung in eine geeignete Buchse und schließen Sie sie an einen Bewässerungsschlauchsatz an, wodurch die Aufnahmekammer angeschlossen wird. Verwenden Sie ein schwerkraftgetriebenes Superfusionssystem. Regulieren Sie den Durchfluss auf 0,5 Milliliter pro Sekunde.Schließen Sie die Kammer an eine Saugvorrichtung an. Regulieren Sie das Lösungssaugsystem mit einer Vakuumpumpe so, dass das Gesamtvolumen der Aufnahmekammer nicht variiert. Um den Augenbestand eines erwachsenen Krebses zu isolieren, lösen Sie ihn mit einer feinen Schere von der Basis.Machen Sie eine Öffnung von einem Quadratmillimeter in der dorsalen Hornhaut mit einer Rasierklinge, um auf die Netzhaut zuzugreifen. Als nächstes legen Sie den Augenstock in der Mitte der Aufnahmekammer mit der Öffnung zur Netzhaut nach oben. Halten Sie das Auge in der Dunkelheit für 20 Minuten.Platzieren Sie die Mikroelektrode parallel zu den Augenbeständen Längsachse so, dass die Mikroelektrode zentriert ist, um auf die Netzhaut zuzugreifen. Verwenden Sie ein stereoskopisches Mikroskop, um die Geräte in der richtigen Konfiguration zu platzieren. Überwachen Sie als Nächstes den Spannungsunterschied zwischen der Referenz- und der Aufnahmeelektroden, indem Sie den Brückenmodus des Verstärkers auswählen.Senken Sie die Elektrode in das Bad und legen Sie sie direkt über die Netzhaut. Entfernen Sie das Mikroskop und positionieren Sie die Photostimulatorlampe parallel zu den Augenbeständen Längsachse. Dann senken Sie langsam die Mikroelektrode, bis ein plötzlicher Spannungsabfall erkannt wird.Anschließend liefern Sie einen Testlichtblitz, um das Rezeptorpotenzial des Photorezeptors aufzuzeichnen. Um geeignete Aufnahmen von lichtentlockten Strömen zu erhalten, ist es wichtig, eine gute Beeinträchtigung einer gesunden Photorezeptorzelle zu machen. Klemmen Sie bei diesem Verfahren die Spannung am gemessenen ruhenden Membranpotential der Zelle, indem Sie die Halteamplitude in der Datenerfassungssoftware auswählen.Wählen Sie dann den DSEVC-Modus des Verstärkers aus. Wählen Sie im Modusbereich des Verstärkers die SEVC-Taste aus und schalten Sie den Hebel auf den Discont um. SEVC-Position.Stellen Sie die Schaltrate auf 500 bis 1.000 Hertz ein, die durch die Elektrodegeschwindigkeit bestimmt wird. Danach liefern Sie einen Lichtblitz und beobachten Sie den evozierten Ionenfluss. Dann liefern Sie ein Paar Lichtimpulse und wenden Sie den zweiten Blitz nach einem gewünschten Zeitintervall an.Digitalisieren Sie die Ströme bei 10-Kilohertz-Sampling mit der Datenerfassungssoftware und speichern Sie die Daten für die Offline-Analyse. Hier ist ein Zwei-Puls-Protokoll zu sehen. Lichtreize wurden bei null Millisekunden und 700 Millisekunden angewendet.Diese Abbildung zeigt die Erholung von der Desensibilisierung. Hier ist Latenz-Recovery, hier ist Peak-Strom-Recovery, und hier ist die Deensitisierungzeit konstante Tau-Wiederherstellung. Die Experimente wurden zu null Stunden zirkadianer Zeit durchgeführt.Diese Abbildung zeigt die Erholung von der Desensibilisierung als Funktion der zirkadianen Zeit. Dies ist iP-Wiederherstellung, dies ist L-Wiederherstellung, und dies ist Tau-Wiederherstellung, und dieses Diagramm zeigt die gewichteten Zeitkonstanten. Biphasische Prozesse sind mit einem Pfeil markiert.Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig gemacht wird. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, zu denken, für eine geringe Geräuschentwicklung und geringe Leckage Strom, Photorezeptor Beeinträchtigung zielen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie pharmakologische Assays, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Einbeziehung bestimmter Kanäle, Rezeptoren oder Signalwege.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurobiologie, um die zirkadiane Zeitabhängigkeit der elektrophysiologischen Eigenschaften von Photorezeptorzellen zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Diesensibilisierung und Wiederherstellung des lichtaktivierten Transduktionsstroms mit der intrazellulären Aufzeichnungstechnik untersuchen können.

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Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

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