Name: efficient generation and editing of feeder-free ipscs from human pancreatic cells using the crispr-cas9 system
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System at JoVE.com

وأيده عمل في المختبر منح زمالات ما بعد الدكتوراه للدكتورة انجالي ناندال، ومنحة الاستكشافية من "صندوق أبحاث الخلايا الجذعية ميريلاند" إلى "بريتيش تيليكوم" (تيدكو).

1-"بروتوكول إعادة برمجة" <ol><li>جيل من اللجنة التوجيهية البشرية من خلايا البنكرياس البشرية الأولية <ol><li>معطف 6-فضلا عن لوحة مع 1.5 ملغ/مل من الكولاجين الباردة والسماح لجل في 37 درجة مئوية حاء – 1</li>
		<li>لوحة مرور أوائل البشرية خلايا البنكرياس الابتدائي في المتوسط الثالث بريجروو (~ 1-1.5 × 10...

<ol>
	<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation.">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette.">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li><li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions.">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612 (2012).</li><li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression.">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594 (2014).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li><li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes.">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559 (2017).</li><li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes.">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li><li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture.">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li><li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+technology:+a+decade+of+progress.">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/HDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes.">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li><li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+CRISPR/Cas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA,+Cas9+nuclease,+and+donor+DNA.">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li></ol>

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية إلى إيبسكس قدم دفعة كبيرة في ميادين البيولوجيا البحوث الأساسية والنمذجة المرض، وتطوير العقاقير والطب يشخص الطب التجديدي16. العديد من الأساليب الحالية والمستخدمة على نطاق واسع من جيل اللجنة التوجيهية البشرية تتطلب استخدام الفيروس مع مخاط?...

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية للدولة pluripotent ب overexpression من إعادة برمجة العوامل قد أحدث ثورة في أبحاث الخلايا الجذعية مع تطبيقات في النمذجة المرض والطب التجديدي، وتطوير العقاقير. تتوفر عدة طرق إعادة برمجة غير الفيروسية لإنجاز إعادة برمجة العوامل وتوليد إيبسكس، ولكن هذه العملية هو العمل المكثف وغير فعالة جداً1. أساليب الفيروسية، على الرغم من كفاءة، ترتبط بمشاكل اندماج الفيروس وتوموريجينيسيتي2،،من34. في هذه المخطوطة، نحن تقرير استخدام هيولى سينداي الفيروس لإيصال إعادة برمجة العوامل وإنشاء خطوط خالية من البصمة اللجنة التوجيهية التي تفتقر إلى التكامل من أي تسلسل النواقل الفيروسية في جينومات على5. سينداي الفيروسات هو فيروس الحمض النووي الريبي التي هي تضعف خارج الخلية السيتوبلازم ~ 10 مقاطع بعد الإصابة وتنتج عوامل إعادة برمجة في وفرة، مما يؤدي إلى سرعة وكفاءة إعادة برمجة6،7. يمكن ثم انتقلت إيبسكس المنشأة إلى متوسط خالية من التغذية لتجنب استخدام الماوس الخلايا الليفية الجنينية (ميفس) كتغذية الخلايا8سهولة.
في هذا المنشور، بالإضافة إلى تحديد الفيروس سينداي بوساطة إعادة برمجة، يصف لنا أيضا بروتوكولا محسنة لتحرير إيبسكس، الذي لديه القدرة على إمداد الخلايا البشرية غير محدود مع التعديلات الوراثية المطلوبة للبحث. وقد استخدمنا التكنولوجيا كريسبر/Cas9 لتعديل إيبسكس، الذي يستخدم الآن لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك ضرب الإضافية والضربة القاضية، والحذف الجينوم واسعة النطاق، مكتبة المجمعة الفحص لاكتشاف الجينات، الهندسة الوراثية العديد من الكائنات الحية النموذجية، والجينات العلاج9،،من1011. هذا الأسلوب ينطوي على تشكيل مجمعات العقدية المقيّحة-المتأتية Cas9 nuclease و 20-مير دليل الكشف أن تحقيق الاعتراف المستهدفة عن طريق قاعدة الاقتران مع تسلسل الجينوم الهدف المجاورة المتاخمة النوكليوتيدات بروتوسباسير 3 ' تسلسل عزر (بام). نوكلياسي Cas9 يدفع النيوكليوتيدات كسر الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة ~ 3 من الموقع بام، الذي تم إصلاحه بعد ذلك غالباً بنهاية غير المتجانسة الانضمام إلى مسار (نهيج) مما يؤدي إلى عمليات الإدراج أو الحذف في إطار القراءة المفتوحة، والوظيفية مما خروج المغلوب من الجينات12.
لدينا بروتوكول تحسين يتضمن التفاصيل للثقافة البشرية خلايا البنكرياس، برمجة على ميتوتيكالي إبطال الماوس الخلايا الليفية الجنينية (ميفس) لتحقيق كفاءة أعلى لإعادة برمجة، التكيف اللاحقة إلى ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق في ماتريجيل، وصف إيبسكس المنشأة، تسترشد كريسبر تصميم الحمض النووي الريبي والتحضير، وإيصالها إلى إيبسكس كمجمعات رنب وحيد الخلية الفرز لتوليد خطوط الاستنساخ من المحرر إيبسكس وسهلة الفحص وتحديد عمليات التحرير، ووصف استنساخ خلية مفردة. الحذف الجينوم تم إنشاؤها بكفاءة في هذه الدراسة بالأخذ بالبروتين Cas9 وهما كريسبر سجرنا رنب مجمعات للحث على فواصل الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة (دسبس) والجزء الحذف التدخل. يستغل هذا الأسلوب استخدام دليلين لتوليد عمليات الحذف في إطار القراءة المفتوحة، وكفاءة عالية نهيج مما أدى إلى انخفاض عدد استنساخ هذا ضرورة أن تتسم، ومن السهل فرز أولى من الحيوانات المستنسخة بشعري الآلي وحدة التفريد، محلل يفتت. قريبا ستصبح هذه الجينوم فعالة تحرير طرق لتوليد نماذج الأمراض البشرية القائمة على الخلايا الجذعية نهج موحد والروتينية في أي مختبر الخلايا الجذعية. وأخيراً، تحرير الجينوم الدقيقة سيجعل من الممكن تذهب إلى أبعد من الخلايا الجذعية مرض النمذجة ومحتملة يمكن أن تساعد في تحفيز العلاجات المستندة إلى الخلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A16517</td>
			<td>Thaw on ice; S No: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco Life Tech</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>0.05%, 100 ml; S No: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>Use 10 &#956;M; S No: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>S No: 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement (KSR)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>S No: 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960069</td>
			<td>1X; S No: 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Aliquot; S No: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1/100; S No: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>1/100; S No: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM, 1/1,000; S No: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td>S No: 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Incubate at 37&#186; C for 1 hour; S No: 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA-4 antibody</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-21704</td>
			<td>1/100; S No: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-81 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4745S</td>
			<td>1/200; S No: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OCT4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>1/1,000; S No: 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td>Keep cold; S No: 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202/A10042</td>
			<td>1/2,000; S No: 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028LS</td>
			<td>1X; S No: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>S No: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353078</td>
			<td>S No: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>S No: 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>S No: 23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picking hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-301</td>
			<td>S No: 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15&#160;ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>S No: 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>S No: 26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11360</td>
			<td>S No: 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>S No: 29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prigrow III medium</td>
			<td>ABM</td>
			<td>TM003</td>
			<td>S No: 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>S No: 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron X-ray system</td>
			<td>Faxitron</td>
			<td>CellRad</td>
			<td>S No: 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell Technologies</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>S No: 34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17104019</td>
			<td>1mg/ml stock; S No: 35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>S No: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC qualified matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td>Stock 10 ug/ml; S No: 38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>4% stock in PBS; S No: 39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-60</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-21705</td>
			<td>1/100; S No: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCAB0004P-F</td>
			<td>1/100; S No: 41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>S No: 42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>00-0055</td>
			<td>S No: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01-50</td>
			<td>Thaw and aliquot; S No: 44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat or donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663/G9023</td>
			<td>S No: 45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>S No: 46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>S No: 47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9285-100ML</td>
			<td>S No: 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>S No: 49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td>S No: 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>S No: 51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega Shortscript T7 kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td>S No: 52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega Clear kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>S No: 53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMC4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354357</td>
			<td>S No: 54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7159</td>
			<td>S No: 55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneJET cloning kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1232</td>
			<td>S No: 56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzerTM</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td></td>
			<td>S No: 57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Warm to room temperature; S No: 58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium mFreSR&#8482;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5855</td>
			<td>S No: 59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium CryoStor&#174;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>S No: 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEFs</td>
			<td>Globalstem</td>
			<td>GSC-6301G</td>
			<td>S No: 61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030081</td>
			<td>S No: 62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cells</td>
			<td>ABM</td>
			<td>T0159</td>
			<td>S No: 63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#8482; Neural Induction Medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td>S No: 64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>S No: 65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27-insulin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>S No: 66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td>S No: 67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72552</td>
			<td>S No: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>S No: 69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10372019</td>
			<td>S No: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td>S No: 71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>S No: 72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Proliant</td>
			<td>68700</td>
			<td>S No: 73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDF8</td>
			<td>Pepro-Tech</td>
			<td>120-00</td>
			<td>S No: 74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1 antibody</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td>S No: 75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-14033</td>
			<td>S No: 76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17 antibody</td>
			<td>R &#38; D systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>S No: 77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>S No: 78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa 4D-nucleofector&#8482;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002</td>
			<td>S No: 79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II (cell sorter)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>SORP UV</td>
			<td>S No: 80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation and editing of feeder-free ipscs from human pancreatic cells using the crispr-cas9 system

يمكن أن الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثه pluripotent الذاتي تجديد وتفرق في أنواع خلايا متعددة من الجسم. Pluripotent الخلايا وبالتالي هي مطمعا للبحوث في مجال الطب التجديدي، وحاليا في التجارب السريرية لأمراض العيون، والسكري، وأمراض القلب، والاضطرابات الأخرى. يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا المتخصصة مقترنا بالتقدم الأخير في الجينوم تحرير التكنولوجيات بما في ذلك نظام كريسبر/Cas قد أتاحت فرصاً إضافية للخياطة الجينوم من اللجنة التوجيهية للتطبيقات المتنوعة بما في ذلك مرض النمذجة، والعلاج الجيني، ويتحامل مسارات التمايز، سبيل المثال لا الحصر. من بين التكنولوجيات المتاحة التحرير، برز كريسبر/Cas9 من العقدية المقيّحة كأداة للاختيار للتحرير الخاصة بالموقع لجينوم حقيقية النواة. كريسبرس يتم الوصول إليها بسهولة وغير مكلفة، وذات كفاءة عالية في هندسة عمليات التحرير المستهدفة. ويتطلب النظام نوكلياسي Cas9 ودليل تسلسل (20-مير) محددة الهدف الجينوم المتاخم 3-النوكليوتيدات "نج" بروتوسباسير-مجاورة-فكرة (بام) لاستهداف Cas9 إلى موضع الجينوم المرجوة، جنبا إلى جنب مع الراسم ملزمة Cas9 عالمي (الحمض النووي الريبي معا تسمى الحمض النووي الريبي دليل واحد أو سجرنا). نقدم هنا خطوة بخطوة بروتوكول لكفاءة توليد اللجنة التوجيهية وحدة تغذية مستقلة وخالية من البصمة ووصف منهجيات للجينوم التحرير للجنة التوجيهية باستخدام مجمعات ribonucleoprotein (رنب) Cas9. جينوم تحرير بروتوكول فعال ويمكن أن يكون متعدد بسهولة من قبل-إلى سجرناس لهدف واحد أو أكثر مع البروتين Cas9 وفي نفس الوقت تقديم في الخلايا. وأخيراً، يصف لنا اتباع نهج مبسطة لتحديد وتوصيف إيبسكس مع التعديلات المطلوبة. أخذت معا، الاستراتيجيات المحددة التي من المتوقع أن تبسيط إنشاء وتحرير للجنة التوجيهية لتطبيقات متعددة.

في هذا المنشور، وقد تابعنا بروتوكول بسيطة ولكنها فعالة للجيل من اللجنة التوجيهية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام التكامل أو ناقلات خالية من بصمة الفيروس سينداي. ويظهر الشكل 1A تمثيل تخطيطي هذا البروتوكول إعادة برمجة. وتم شراء خلايا البنكرياس البشرية...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System at JoVE.com

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

بروتوكول يصف بالتفصيل جيل خال من البصمة المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس) من خلايا البنكرياس البشرية في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق، تبع هذا التحرير باستخدام ريبونوكليوبروتينس كريسبر/Cas9 وتوصيف لتعديل استنساخ الخلايا المفردة.

كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

The overall goal of this procedure is to generate footprint-free induced pluripotent stem cells or IPSCs from human pancreatic cells in feeder-free conditions, then to edit the cells using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and finally to characterize the modified single cell clones. This method can help answer key questions in the human stem cell genome editing field such as generation of footprint-free IPSCs and editing with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. The main advantage of this technique is that clonal lines of edited IPSCs can be generated with high reliability and there is no evidence of mosaicism.After coating a six well plate with cold collagen, plate early passage human primary pancreatic cells in Prigrow III medium on day 2 to achieve approximately 2.5 x 10 to the 5 cells or at least 60%confluency per well on the day of transduction or day zero. On the day of transduction after harvesting and counting the cells according to the text protocol, thaw on ice one set of Sendai vector tubes and carefully add the calculated volumes of each tube to 1 mL of prewarmed Prigrow III medium. Gently pipette to mix the solution.Aspirate the Prigrow III from the cells and slowly add the reprogramming virus mixture to the wells. Then incubate the cells in a 37 degree Celsius incubator overnight. Twenty-four hours after transduction, carefully discard the virus mixture on the cells and replace it with fresh Prigrow III medium.On day six, add 1 mL of cell detachment solution to the cells and incubate them for 10 minutes. Then, using Prigrow III with rock inhibitor, plate all the cells on dishes of MEFs prepared the day before. Incubate the cells at 37 degrees Celsius overnight.Observe the plates regularly for the emergence of cell clumps or colonies indicative of reprogrammed cells which will form clonal aggregates with a cobblestone morphology and a big nucleus and nucleoli. Mark the probable IPSC colonies and regularly check them for growth. Almost four weeks following transduction after preparing 24 well MEF plates, prepare matrix membrane by aliquoting it based on the dilution factor on the certificate of analysis.Pick 24-48 colonies and transfer them onto matrix membrane coated 24 well plates with mTeSR1. Incubate the plates for 24 hours and change the medium every day. Refer to the text protocol for additional details.Add 500 mcL of dispase to detach the robust colonies plated on the matrix membrane. After incubating the cells for 20 minutes, plate them again on matrix membrane coated 12 well plates. Expand and characterize the clones using alkaline phosphatase staining, immuno staining and FACS analysis according to the text protocol.To transfect HIPSCs after synthesizing SGRNAs according to the text protocol, prepare nucleofaction master mix for each sample by combining 0.5 mcg of Cas9 protein and 0.5 mcg of each SGRNA in a 22 mcL reaction volume. After aspirating the medium containing rock inhibitor, use 2 mL of RTPBS to wash each well of ISPCs. Then aspirate the PBS and add 1 mL of cell detachment solution.Incubate the plate at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Resuspend the cells in 3 mL of mTeSR1 medium and gently pipette up and down to generate a single cell suspension. Transfer the dissociated cells to a 15 mL centrifuge tube containing 5 mL of mTeSR1 medium.To the nucleofection master mix, add 16.4 mcL of P3 primary cell supplement and 3.6 mcL of supplement one from the Nucleofector kit. After counting and spinning the cells, resuspend each unit of 0.5 x 10 to the 6th cells in 22 mcL of the previously prepared transfection master mix. Quickly transfer the cells into the central chamber of one well of a Nucleocuvette strip.Then, place the strip into a Nucleofector device and nucleofect the cells using program CB150. Following nucleofection, quickly add 80 mcL of prewarmed mTeSR1 medium containing 10 micromolar rock inhibitor to each well of the nucleofected cells. Gently mix by pipetting up and down.Gently transfer the cells from the strip to wells of the matrix membrane precoated 12 well plate containing mTeSR1 medium with rock inhibitor. On the second day of incubation after preparing MEF plates, replace the medium on the HIPSCs from mTeSR1 to mTeSR1 supplemented with 1XSMC4 for at least two hours before single cell sorting. Aspirate the medium from HIPSCs and use PBS to gently wash the cells.Then add 500 mcL of cell detachment solution into each well and incubate the cells at 37 degrees Celsius for 10 minutes. Generate a single cell suspension by adding 1 mL of mTeSR1 to each well and gently pipette up and down several times. Sort single cells into individual wells of a previously prepared 96 well plate.Four days after sorting, colony formation should be apparent. At this point, replace the culture medium with HESC medium supplemented with 1X SMC4. After extracting and expanding the target DNA according the text protocol, use a fragment analyzer kit to run the PCR amplified target genomic region of all clones through the gel dye mix per the manufacturer's instructions.Confirm pluripotent IPSC clones according to the text protocol. Before Sendai virus transduction, pancreatic cells show typical spindle-like morphology. Small tight colonies appear on MEFs by day 12 resembling human pluripotent cell colonies.Normally, the fully reprogrammed human IPSC colonies have very clear boundaries and can be picked up by days 23 to 30. A dissociated colony at day 23 is shown here. Presented here is a typical phase contrast image of an IPSC colony after picking and culture in feeder-free conditions after Sendai virus reprogramming of pancreatic cells.Alkaline phosphatase stained red IPSC colonies are on the right. IPSCs were confirmed by immuno staining for the pluripotency markers OCT4 and NANOG as seen in these panels. In this experiment, IPSCs were stained with cell surface markers and FACS analysis was carried out on a single cell suspension.The green peak represents pancreatic IPSCs, and the purple peak contains IPSC negative cells. While attempting this procedure, it is important to remember to maintain aseptic or sterile conditions for cell sorting and cell culture. Following this procedure, other methods like gene targeting in IPSCs and ESCs can be performed, and additional questions can be answered by performing precise genetic modifications.After watching this video, you should have a good understanding of how to reliably generate footprint-free and feeder-free IPSCs and perform genome editing biallelically.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

تسليم الجينات والخلايا البشرية في ترنسفكأيشن سرطان البنكرياس باستخدام مستقبلات عامل نمو البشرة استهداف الجيلاتين المستندة Nanovectors المهندسة

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

إنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا عن طريق الحقن برونوكلير من مجمع كريسبر/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection "روتوورم الذرة الغربية"، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، والأجنة لتحويل الخط، أو تحرير الجينوم كريسبر/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

جيل نانوليبوسوميس الموجبة لتسليم كفاءة في المختبر نسخها رسول الجيش الملكي النيبالي

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

تنقية وتحليل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من خلايا المبيض الهامستر الصينية باستخدام نظام مفاعل ميكروبيوم الآلي

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغين من جلد البطن وتوليد مستحث المستحثة باستخدام أسلوب غير دمج

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...