Name: efficient generation and editing of feeder-free ipscs from human pancreatic cells using the crispr-cas9 system
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System at JoVE.com

Arbeid i laboratoriet ble støttet av postdoktorstipend tilskudd til Dr. Anjali Nandal og utforskende grant fra Maryland Stem Cell Research Fund til BT (TEDCO).

1. omprogrammering protokollen <ol><li>generasjon av menneskelig iPSC fra primære menneskelige bukspyttkjertelen celler <ol><li>Coat en 6-godt plate med 1.5 mg/mL kaldt kollagen og la den gel på 37 ° C i 1 h.</li>
		<li>Plate tidlig passering menneskelige primære bukspyttkjertelen celler i Prigrow III medium (~ 1-1,5 × 10 5 celler) på en kollagen belagt 6-vel plate på dag -2 å oppnå ca 2,5 × 10 5 celler eller minst 60% confluency per på dag signaltransduksjon (dag 0). ...

<ol>
	<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation.">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette.">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li><li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions.">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612 (2012).</li><li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression.">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594 (2014).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li><li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes.">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559 (2017).</li><li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes.">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li><li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture.">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li><li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+technology:+a+decade+of+progress.">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/HDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes.">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li><li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+CRISPR/Cas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA,+Cas9+nuclease,+and+donor+DNA.">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li></ol>

Omprogrammering av menneskelig somatiske celler til iPSCs har gitt en viktig vitamininnsprøytning til grunnleggende biologi forskning, personlig medisin, sykdom modellering, narkotika utvikling og regenerativ medisin16. Mange nåværende og brukte metoder for menneskelig iPSC generasjon krever bruk av virus med risikoen for integrering i vert genomet eller episomal vektorer med lav omprogrammering effektivitet. Her presenterer vi en effektiv metode for å generere mater-gratis iPSCs fra menneskel...

Omprogrammering av menneskelig somatiske celler pluripotent tilstanden av overuttrykte omprogrammering faktorer har revolusjonert stamcelleforskning programmer sykdom modellering og regenerativ medisin narkotika utvikling. Flere ikke-viral reprogramming metoder er tilgjengelige for levering av reprogramming faktorer og generere iPSCs, men prosessen er arbeidskraft intensiv og ikke veldig effektivt1. Metodene viral, er men effektiv, forbundet med virus integrering og tumorigenicity2,3,4. I dette manuskriptet rapporterer vi bruk av cytoplasmatiske Sendai virus for levere omprogrammering faktorer og etablere fotavtrykk-fri iPSC linjer som mangler integrering av en viral vektor sekvenser i deres genomer5. Sendai virus er en RNA-virus som er utvannet av cellen cytoplasma ~ 10 passeringer etter smitte og produserer omprogrammering faktorer i overflod, fører til rask og effektiv omprogrammering6,7. De etablerte iPSCs kan så lett bli overført til mater-fri medium for å unngå bruk av mus embryonale fibroblaster (MEFs) som mater celler8.
I publikasjonen, i tillegg til disposisjon Sendai viruset mediert reprogramming, beskriver vi også en forbedret protokoll for redigering iPSCs, som har potensial til å levere ubegrenset menneskelige celler med genetiske endringer for forskning. Vi har brukt CRISPR/Cas9-teknologi for ombygging av iPSCs, som nå brukes for en rekke applikasjoner inkludert knock-ins og fortrenging, store genomisk slettinger, gruppert biblioteket screening for gen funnet, genteknologi av mange modell organismer og gene terapi9,10,11. Denne teknikken innebærer dannelsen av komplekser av Streptococcus pyogenes-avledet Cas9 nuclease og 20-mer guide RNAs oppnå målet anerkjennelse via base-sammenkobling genomisk målet sekvens ved 3 nucleotide protospacer tilstøtende motiv (PAM) rekkefølge. Cas9 nuclease induserer en dobbel strandet pause ~ 3 nukleotider fra webområdet PAM, som er senere reparerte hovedsakelig av ikke-homologe enden med (NHEJ) veien fører til innsettinger eller slettinger i åpent lesing rammen, og dermed funksjonelle knockout gener12.
Våre forbedret protokollen inneholder detaljene for kultur av menneskelige bukspyttkjertelen celler, deres omprogrammering på mitotically inaktivert mus embryonale fibroblaster (MEFs) for å oppnå høyere effektivitet med reprogramming, etterfølgende tilpasning til mater-fri kultur på Matrigel, karakterisering av etablerte iPSCs, guidet CRISPR RNA design og forberedelse, leveres til iPSCs som RNP komplekser, enkeltcelle sortering for å generere klonal linjer med redigerte iPSCs, enkel screening og identifikasjon av redigeringer og karakterisering av enkelt celle kloner. Genomic slettinger genereres effektivt i denne studien av innføringen av Cas9 protein og to CRISPR sgRNA RNP komplekser å indusere dobbel strandet bryter (DSBs) og sletting av de mellomliggende segment. Denne metoden kapitaliserer på bruk av to guider for å generere slettinger i åpent lesing rammen, høy effektivitet av NHEJ fører til lavt antall kloner som måtte være preget og lett foreløpige screening av kloner av av automatiserte kapillær geleelektroforese enhet, fragment analyzer. Disse effektiv genomet redigering metoder for å generere modeller for menneskelig stilk cellen-basert sykdom vil snart bli en standard og rutine tilnærming i noen stamcelleforskningen laboratorium. Endelig presis genomet redigering gjør det mulig å gå utover stamcelleforskningen sykdom modellering og potensielt kunne hjelpe katalysere cellen-basert behandling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A16517</td>
			<td>Thaw on ice; S No: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco Life Tech</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>0.05%, 100 ml; S No: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>Use 10 &#956;M; S No: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>S No: 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement (KSR)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>S No: 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960069</td>
			<td>1X; S No: 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Aliquot; S No: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1/100; S No: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>1/100; S No: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM, 1/1,000; S No: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td>S No: 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Incubate at 37&#186; C for 1 hour; S No: 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA-4 antibody</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-21704</td>
			<td>1/100; S No: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-81 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4745S</td>
			<td>1/200; S No: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OCT4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>1/1,000; S No: 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td>Keep cold; S No: 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202/A10042</td>
			<td>1/2,000; S No: 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028LS</td>
			<td>1X; S No: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>S No: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353078</td>
			<td>S No: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>S No: 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>S No: 23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picking hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-301</td>
			<td>S No: 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15&#160;ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>S No: 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>S No: 26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11360</td>
			<td>S No: 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>S No: 29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prigrow III medium</td>
			<td>ABM</td>
			<td>TM003</td>
			<td>S No: 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>S No: 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron X-ray system</td>
			<td>Faxitron</td>
			<td>CellRad</td>
			<td>S No: 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell Technologies</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>S No: 34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17104019</td>
			<td>1mg/ml stock; S No: 35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>S No: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC qualified matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td>Stock 10 ug/ml; S No: 38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>4% stock in PBS; S No: 39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-60</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-21705</td>
			<td>1/100; S No: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCAB0004P-F</td>
			<td>1/100; S No: 41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>S No: 42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>00-0055</td>
			<td>S No: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01-50</td>
			<td>Thaw and aliquot; S No: 44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat or donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663/G9023</td>
			<td>S No: 45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>S No: 46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>S No: 47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9285-100ML</td>
			<td>S No: 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>S No: 49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td>S No: 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>S No: 51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega Shortscript T7 kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td>S No: 52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega Clear kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>S No: 53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMC4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354357</td>
			<td>S No: 54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7159</td>
			<td>S No: 55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneJET cloning kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1232</td>
			<td>S No: 56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzerTM</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td></td>
			<td>S No: 57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Warm to room temperature; S No: 58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium mFreSR&#8482;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5855</td>
			<td>S No: 59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium CryoStor&#174;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>S No: 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEFs</td>
			<td>Globalstem</td>
			<td>GSC-6301G</td>
			<td>S No: 61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030081</td>
			<td>S No: 62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cells</td>
			<td>ABM</td>
			<td>T0159</td>
			<td>S No: 63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#8482; Neural Induction Medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td>S No: 64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>S No: 65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27-insulin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>S No: 66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td>S No: 67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72552</td>
			<td>S No: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>S No: 69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10372019</td>
			<td>S No: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td>S No: 71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>S No: 72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Proliant</td>
			<td>68700</td>
			<td>S No: 73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDF8</td>
			<td>Pepro-Tech</td>
			<td>120-00</td>
			<td>S No: 74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1 antibody</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td>S No: 75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-14033</td>
			<td>S No: 76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17 antibody</td>
			<td>R &#38; D systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>S No: 77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>S No: 78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa 4D-nucleofector&#8482;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002</td>
			<td>S No: 79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II (cell sorter)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>SORP UV</td>
			<td>S No: 80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation and editing of feeder-free ipscs from human pancreatic cells using the crispr-cas9 system

Embryonale og indusert pluripotent stamceller kan selv-fornye og skille ut flere celletyper i kroppen. Pluripotent cellene er dermed ettertraktet for forskning i regenerativ medisin og er nå i kliniske studier for øyesykdommer, diabetes, hjertesykdommer og andre sykdommer. Potensial til å skille ut spesialiserte celletyper kombinert med den siste utviklingen i genomet redigering teknologier inkludert CRISPR/Cas systemet har gitt av flere muligheter for skreddersøm genomet av iPSC for blandet kjøring inkludert sykdom modellering, genterapi, og biasing veier av differensiering, for å nevne noen. Blant de tilgjengelige redigering teknologiene, CRISPR/Cas9 fra Streptococcus pyogenes har dukket opp som et verktøy for valg for områdespesifikke redigering av eukaryote genomet. CRISPRs er lett tilgjengelig, billig og svært effektiv i ingeniørfag målrettet redigeringer. Systemet krever en Cas9 nuclease og en guide-sekvens (20-mer) gjelder for genomisk målet tilstøtende en 3-nukleotid "NGG" protospacer-tilstøtende-motiv (PAM) for målretting Cas9 til ønsket genomisk locus, sammen med en universell Cas9 binding tracer RNA ( "kalt sammen enkelt støttelinje RNA eller sgRNA). Her presenterer vi et trinnvist protokoll for effektiv generasjon av mater-uavhengig og fotavtrykk-fri iPSC og beskriver metoder for genomet redigering av iPSC bruker Cas9 ribonucleoprotein (RNP) komplekser. Genomet redigering protokollen er effektivt og kan være lett multiplekset av pre-complexing sgRNAs for flere mål med Cas9 protein og samtidig levere inn i cellene. Til slutt, beskriver vi en forenklet tilnærming for identifikasjon og karakterisering av iPSCs med ønskede endringer. Samlet forventes disponerte strategier å effektivisere generasjon og redigering av iPSC for mange programmer.

I denne publikasjonen, har vi fulgt en enkel, men effektiv protokoll for generering av iPSC fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av integrasjon eller fotavtrykk-fri Sendai virus vektorer. Figur 1A viser en skjematisk fremstilling av denne reprogramming protokollen. De menneskelige bukspyttkjertelen cellene ble kjøpt kommersielt, kultivert i Prigrow III medium og transduced med Sendai virus som forklart ovenfor. Transduced spindel formet bukspy...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System at JoVE.com

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Denne protokollen beskriver i detalj generering av fotavtrykk-fri indusert pluripotent stamceller (iPSCs) fra menneskelig bukspyttkjertelen celler i arkmateren uten betingelser, etterfulgt av redigering med CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins og karakterisering av endret encellede kloner.

Effektiv generasjon og redigering av mater-gratis IPSCs fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering og Transfeksjon i Human kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av epidermal vekstfaktorreseptor målrettede Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utvikling, utvidelse, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvåking of Human NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs) og og Induced pluripotent stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generering av MGP-avledet Mouse Airway Epitelceller Bruke Decellularized Lung Stillas

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Produksjon av genmodifiserte Golden syrer Hamsters ved Pronuclear injeksjon av CRISPR/Cas9 komplekset

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Western mais Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryo for Germline transformasjon eller CRISPR/Cas9 genomet redigering

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generering av kationisk Nanoliposomes for effektiv levering av In Vitro transkribert budbringer RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensing og analyse av en monoklonale antistoff fra kinesisk hamster eggstokk celler ved hjelp av en automatisert Microbioreactor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolering av voksen Human dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering av indusert Pluripotent stamceller ved hjelp av en ikke-integrering metode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generasjon av modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...