Name: efficient generation and editing of feeder-free ipscs from human pancreatic cells using the crispr-cas9 system
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System at JoVE.com

Работа в лаборатории был поддержан докторской стипендии Грант доктор Анджали Nandal и исследовательский грант от Фонда исследований стволовых клеток Мэриленд для BT (ТЕДКО).

1. перепрограммирование протокол <ol><li>поколения человека iPSC от первичных человеческих клеток поджелудочной железы <ol><li>пальто 6-ну пластины с 1,5 мг/мл холодной коллагена и позволить ему гель при 37 ° C за 1 ч.</li>
		<li>Тарелка скорейшее прохождение человека первичных клеток поджелу?...

<ol>
	<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation.">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette.">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li><li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions.">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612 (2012).</li><li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression.">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594 (2014).</li><li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing.">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li><li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes.">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559 (2017).</li><li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes.">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li><li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture.">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li><li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+technology:+a+decade+of+progress.">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/HDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes.">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li><li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+CRISPR/Cas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA,+Cas9+nuclease,+and+donor+DNA.">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li></ol>

Перепрограммирование соматических клеток человека к iPSCs предоставила значительный импульс в области фундаментальной биологии исследований, персонализированной медицины, болезни моделирования, разработки лекарственных средств и регенеративной медицины16. Многие текущи...

Перепрограммирование человека соматические клетки pluripotent государству, гиперэкспрессия перепрограммирования факторов революцию исследования стволовых клеток с приложениями моделирования заболевания, регенеративной медицины и разработки лекарственных средств. Несколько не вирусный перепрограммирования методы доступны для доставки перепрограммирования факторы и генерации iPSCs, но этот процесс является труда интенсивной и не очень эффективно1. Вирусные методы, хотя эффективное, связаны с проблемами вирус интеграции и tumorigenicity2,3,4. В этой рукописи мы сообщают об использовании цитоплазматических Сэндай вируса для доставки перепрограммирования факторы и создания свободных след iPSC линий, которые отсутствие интеграции любой вирусный вектор последовательности в их геном5. РНК вирус, который разводится из клеток цитоплазме ~ 10 ходов после инфекции и производит перепрограммирования факторов в изобилии, приводит к быстрой и эффективной перепрограммирования6,7является Сендай. Установленные iPSCs можно затем легко перешли на фидер свободный средних и избежать использования мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) как фидер клетки8.
В этой публикации, наряду с изложением Сэндай вирус опосредованной перепрограммирования мы также описывают улучшение протокол для редактирования iPSCs, который имеет потенциал, чтобы предоставить неограниченное количество клеток человека с желаемой генетических модификаций для научных исследований. Мы использовали технологию ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для модификации iPSCs, который в настоящее время используется для широкого спектра приложений, включая стук ins и нокауты, крупномасштабные геномной удаления, Объединенные библиотеки проверки для обнаружения гена, генная инженерия многочисленные модели организмов и генной терапии9,10,11. Этот метод предполагает формирование комплексов Streptococcus pyogenes-производные Cas9 Нуклеаза и 20-mer руководство РНК, обеспечивающие признание целевой через базу сопряжения с геномные последовательности прилегающих к 3' нуклеотидом protospacer соседними мотив (PAM) последовательности. Cas9 Нуклеаза индуцирует двойной мель перерыв ~ 3 нуклеотидов с PAM сайта, который впоследствии восстановленной преимущественно концу не гомологичных присоединения (NHEJ) путь, ведущий к вставки или удаления в рамках открытой чтении и тем самым функциональным нокаут гены12.
Наша Улучшенная протокол включает в себя сведения о культуре человеческих клеток поджелудочной железы, их перепрограммирования на mitotically инактивированная мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) для достижения более высокой эффективности перепрограммирование, последующей адаптации к культуре фидер бесплатно на Matrigel, характеристика установленных iPSCs, ТРИФОСФАТЫ руководствоваться РНК дизайн и подготовка, Доставка в iPSCs как RNP комплексы, одну ячейку Сортировка для создания клоновых линий редактировать iPSCs, легко отбора и идентификации изменений и характеристика Одноячеистый клонов. Геномной удаления эффективно были созданы в этом исследовании путем введения Cas9 белка и два ТРИФОСФАТЫ sgRNA RNP комплексов побудить двойной мель перерывы (DSBs) и исключить вмешательство сегмента. Этот метод основывается на использовании двух руководств для генерации исключений в рамках открытой чтении, высокая эффективность NHEJ приводит к низкой количество клонов что необходимо охарактеризовать и легко предварительного отбора клонов, автоматизированных капилляров электрофорез блок, фрагмент анализатора. Эти эффективные генома, редактирование методы для создания модели на основе стволовых клеток заболеваний человека вскоре станет стандартной и обычные подход в любой лаборатории стволовых клеток. Наконец точное генома редактирования позволит выйти за рамки моделирования заболевания стволовых клеток и потенциально может помочь стимулировать клетки-терапии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A16517</td>
			<td>Thaw on ice; S No: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco Life Tech</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>0.05%, 100 ml; S No: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td>Use 10 &#956;M; S No: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>S No: 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum replacement (KSR)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>S No: 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960069</td>
			<td>1X; S No: 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Aliquot; S No: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>1/100; S No: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>1/100; S No: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>55 mM, 1/1,000; S No: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td>S No: 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Incubate at 37&#186; C for 1 hour; S No: 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA-4 antibody</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>sc-21704</td>
			<td>1/100; S No: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-81 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4745S</td>
			<td>1/200; S No: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;OCT4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>1/1,000; S No: 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td>Keep cold; S No: 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202/A10042</td>
			<td>1/2,000; S No: 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028LS</td>
			<td>1X; S No: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>S No: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353078</td>
			<td>S No: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>S No: 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>S No: 23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picking hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-301</td>
			<td>S No: 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15&#160;ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>S No: 25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>S No: 26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11360</td>
			<td>S No: 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>S No: 29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prigrow III medium</td>
			<td>ABM</td>
			<td>TM003</td>
			<td>S No: 31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
			<td>S No: 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron X-ray system</td>
			<td>Faxitron</td>
			<td>CellRad</td>
			<td>S No: 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative cell Technologies</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>S No: 34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17104019</td>
			<td>1mg/ml stock; S No: 35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>S No: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC qualified matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>233-FB</td>
			<td>Stock 10 ug/ml; S No: 38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>4% stock in PBS; S No: 39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-1-60</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-21705</td>
			<td>1/100; S No: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG</td>
			<td>ReproCELL</td>
			<td>RCAB0004P-F</td>
			<td>1/100; S No: 41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td>S No: 42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>00-0055</td>
			<td>S No: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>CP01-50</td>
			<td>Thaw and aliquot; S No: 44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat or donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663/G9023</td>
			<td>S No: 45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td>S No: 46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>S No: 47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9285-100ML</td>
			<td>S No: 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td>S No: 49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td>S No: 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>S No: 51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega Shortscript T7 kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1354</td>
			<td>S No: 52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega Clear kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>S No: 53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMC4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354357</td>
			<td>S No: 54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7159</td>
			<td>S No: 55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneJET cloning kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1232</td>
			<td>S No: 56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment analyzerTM</td>
			<td>Advanced Analytical</td>
			<td></td>
			<td>S No: 57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Warm to room temperature; S No: 58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium mFreSR&#8482;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5855</td>
			<td>S No: 59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium CryoStor&#174;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td>S No: 60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEFs</td>
			<td>Globalstem</td>
			<td>GSC-6301G</td>
			<td>S No: 61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030081</td>
			<td>S No: 62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cells</td>
			<td>ABM</td>
			<td>T0159</td>
			<td>S No: 63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#8482; Neural Induction Medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td>S No: 64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>S No: 65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27-insulin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1895601</td>
			<td>S No: 66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td>S No: 67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWP4</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>72552</td>
			<td>S No: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% B27</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>S No: 69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10372019</td>
			<td>S No: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8761-100ML</td>
			<td>S No: 71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>S No: 72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Proliant</td>
			<td>68700</td>
			<td>S No: 73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDF8</td>
			<td>Pepro-Tech</td>
			<td>120-00</td>
			<td>S No: 74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1 antibody</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td>S No: 75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKX2-5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-14033</td>
			<td>S No: 76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17 antibody</td>
			<td>R &#38; D systems</td>
			<td>AF1924</td>
			<td>S No: 77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>S No: 78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa 4D-nucleofector&#8482;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002</td>
			<td>S No: 79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II (cell sorter)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>SORP UV</td>
			<td>S No: 80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation and editing of feeder-free ipscs from human pancreatic cells using the crispr-cas9 system

Эмбриональные и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток может самостоятельно обновить и дифференцироваться в несколько типов клеток тела. Плюрипотентных клеток таким образом желанной для исследований в регенеративной медицине и в настоящее время в клинических испытаниях для глазных заболеваний, диабета, заболеваний сердца и других расстройств. Потенциал, чтобы дифференцироваться в типы специализированных клеток в сочетании с последних достижений в геноме, редактирования технологий, включая системы ТРИФОСФАТЫ/Cas предоставили дополнительные возможности для пошива геном iPSC для разнообразных приложений включая моделирование, болезней генотерапии и стабилизатор пути дифференциации, чтобы назвать несколько. Среди доступных технологий редактирования ТРИФОСФАТЫ/Cas9 от Streptococcus pyogenes возникла как инструмент выбора для редактирования участкам генома эукариот. CRISPRs легко доступны, недорогих и высокоэффективных технических целевых изменения. Система требует Cas9 Нуклеаза и руководство последовательности (20-mer), относящиеся к genomic цели примыкающих 3-нуклеотид «НЭС» protospacer рядом мотив (PAM) для ориентации Cas9 желаемого геномной локус, наряду с трассирующими универсальная Cas9 связывания РНК ( Вместе они называются одной руководство РНК или sgRNA). Здесь мы представляем пошаговые протокол для эффективного поколения фидер независимых и свободных след iPSC и описания методологий для изменения генома в iPSC, используя комплексы рибонуклеопротеида (RNP) Cas9. Геном редактирования протокола является эффективным и может быть легко мультиплексируются по pre комплексообразования sgRNAs для более чем одной цели с Cas9 белками и одновременно доставлять в клетки. Наконец мы описываем упрощенный подход для идентификации и определения характеристик iPSCs с желаемых изменений. Взятые вместе, изложил стратегии предполагается упростить создание и редактирование iPSC для многочисленных приложений.

В этой публикации мы следим за простой, но эффективный протокол для поколения iPSC от человеческих клеток поджелудочной железы с помощью интеграции или след свободный вирус Сэндай векторов. Рисунок 1A показывает схематическое изображение этой перепрогр...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System at JoVE.com

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Протокол описывает подробно поколения след бесплатный индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) от человеческих клеток поджелудочной железы в фидер свободных условиях, вслед за этим редактирования с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 ribonucleoproteins и характеристика изменение клоны одноклеточных.

Эффективное создание и редактирование фидер свободный IPSCs от человеческих клеток поджелудочной железы, с использованием системы ТРИФОСФАТЫ Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Доставка генов и Трансфекция в человеческий рак поджелудочной железы клетки, используя эпидермального фактора роста рецепторов ориентированных Желатин основе Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Развитие, расширение и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Контроль за соблюдением NK-клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Генерация ESC происхождения мыши эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием легких Decellularized Строительные леса

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Производство генетически Золотой сирийских хомяков Pronuclear инъекции комплекса ТРИФОСФАТЫ/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Микроинъекции Западной кукуруза Rootworm, под эгидой содействие, эмбрионы для преобразования микрофлорой, или изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Поколение катионного Nanoliposomes для эффективной доставки в Vitro транскрипции РНК

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Очистка и аналитика моноклонального антитела от китайских яичников хомяка с помощью автоматизированной системы микробиореактора

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Изоляция взрослых человека дермальных фибробластов от кожи брюшной полости и поколение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием неинтегрирующего метода

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...