Name: production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

البحث عنها في هذا المنشور وأيد من "المعاهد الوطنية للحساسية" والأمراض المعدية (نييد) من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة 1R41OD021979 رقم (إلى ZW) ومنحة بحثية من 21 BioGreen الجيل القادم منح البرنامج، جمهورية كوريا، لا. PJ01107704 (إلى ZW) ولا تمنح. PJ01107703 (لايك). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو 21 بيوجرين. ونحن نشكر الدكتور نيكولاس روبل لتحرير المخطوطة.

وافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية يوتا الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول (بروتوكول إياكوك: 2484). المستخدمة في هذا البروتوكول قداد الكبار (6-10 أسابيع عمر) [لفغ] سلالة الهامستر السوري الذهبي. قداد جميع يسكن في فيفاريوم في مركز بيوينوفيشن، جامعة ولاية يو?...

<ol>
	<li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease.">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li><li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds.">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li><li>Thomas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+as+a+permissive+immunocompetent+animal+model+for+the+study+of+oncolytic+adenovirus+vectors.">Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors.</a> Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).</li><li>Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Syrian+hamster+as+an+animal+model+for+oncolytic+adenovirus+vectors.">Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors.</a> Methods Mol Med. , 169-183 (2007).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever.">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li><li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters.">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li><li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis.">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li><li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum:+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies.">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li><li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome.">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li><li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR/Cas9+system.">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).</li><li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins:+pantothenate+stimulates+blastocyst+production.">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li></ol>

أفضل استغلال إمكانات الهامستر السوري الذهبي كنماذج للأمراض البشرية، قمنا بتطوير بروتوكول حقن PN لإيصال كريسبر/Cas9 معقدة لاستهداف الجينوم الهامستر. بروتوكول الحقن PN يحسن عدة متغيرات رئيسية بما في ذلك الجنين الثقافة المتوسطة، ودرجة الحرارة، والاطوال الموجية ل الضوء13. وهناك أي?...

الهمستر السوري الذهبي (Mesocricetus الذهبي) واحد من القوارض الأكثر استخداماً للبحوث الطبية الحيوية. ووفقا "وزارة الزراعة الأمريكية"، واستخدمت قداد 100,000 تقريبا في الولايات المتحدة في عام 2015، الذين يمثلون 13% استخدام مختبر مجموع الحيوانات فيما بين الأنواع المشمولة "قانون رعاية الحيوان" (http://www.aphis.usda.gov; الوصول إلى 10 مارس 2017).
الهمستر يوفر العديد من المزايا الأخرى القوارض في الدراسة لعدد من الأمراض التي تصيب الإنسان. على سبيل المثال، adenocarcinomas الأقنية البنكرياس الأنسجة من N-nitrosobis(2-oxopropyl) أمين (ميزان المدفوعات) التي يسببها في الهامستر مماثل لاورام البنكرياس البشرية، بينما يدفع أسعار صرف العلاج أساسا أورام الغدة الدرقية في الفئران والرئة وأورام الكبد في 1من الفئران. لأن الهامستر هي القوارض الصغيرة فقط وجدت لدعم النسخ متماثل غدية، وهم أيضا النموذج المفضل لاختبار العقاقير المضادة إتش2،،من34ومتجهات أونكوليتيك المستندة إلى إتش. مثال آخر حيث يقدم نموذج الهامستر ميزة على الفئران والجرذان في دراسة الدهون. البشر والهامستر معرض للتشابه الكبير في الدهون الأيضية وتحمل الجينات ترميز cholesteryl إستر نقل البروتين (التبادل)، الذي يلعب دوراً محوريا في دهن الأيض، بينما يتم التبادل غائبة في الفئران والجرذان5من كل الأنواع. بالإضافة إلى ذلك، وضع الهامستر النزفية مرض أكثر تمثيلاً لمظاهر البشرية بعد التعرض ل فيروس الإيبولا6. قداد أيضا نماذج الاختيار لدراسة تصلب الشرايين7، وسرطانات الفم8، والتهاب ميوباثيس9. في الآونة الأخيرة، كما ثبت أن الهامستر تكون عرضه للإصابة بعدوى الفيروس الأنديز وتطوير فيروس هانتا الرئوية مثل متلازمة المرض، تقديم نموذج القوارض فقط من الإصابة بالفيروس الأنديز10.
لمعالجة الحاجة غير الملباة لرواية النماذج الحيوانية الوراثية لدراسة الأمراض البشرية التي يتوفر فيها لا نموذج القوارض صغيرة يمكن الاعتماد عليها، نحن قد نجحت في تطبيق نظام كريسبر/Cas9 إلى الهامستر مؤخرا وقد أنتجت عدة أسطر من وراثيا هندسة قداد11. زيجوتيس الهامستر حساسة للغاية للأوساط البيئية أن البروتوكولات حقن PN نمواً في الأنواع الأخرى غير مناسبة. ولذلك، علينا وضع بروتوكول حقن PN الهامستر يتوافق مع المتطلبات الخاصة للتعامل مع الهامستر أجنة في المختبر. هنا، نحن تصف الإجراء حقن PN مفصلة باستخدام نظام كريسبر/Cas9 والخطوات المرافقة، من إعداد دليل واحد الحمض النووي الريبي (سجرنا) لنقل الأجنة حقنه في الإناث المتلقية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B25640</td>
			<td>1 ug/ul (~6.1 uM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArtTM Precision Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A29377</td>
			<td>For sgRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from human serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td>For cultivation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-150</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>Galaxy 14S</td>
			<td>For embryo cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PB-7</td>
			<td>For making injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti-S</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1840</td>
			<td>Keep in dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877-2000IU</td>
			<td>For superovulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex

تقنية حقن (PN) pronuclear أنشئت أول مرة في الفئران لإدخال المواد الجينية الأجنبية في برونوكلي الأجنة مرحلة خلية واحدة. عرض المواد الجينية قد دمج الجينوم الجنينية وتوليد الحيوانات المحورة وراثيا مع المعلومات الجينية الأجنبية بعد نقل الأجنة حقن لتشجيع الأمهات. وعقب النجاح الذي حققه في الفئران، تم تطبيق حقن PN بنجاح في العديد من أنواع الحيوانات الأخرى. في الآونة الأخيرة، حقن السند الإذني قد استخدمت بنجاح لإدخال الكواشف مع تعديل الجينات الأنشطة، مثل نظام كريسبر/Cas9، لتحقيق التعديلات الوراثية الخاصة بالموقع في المختبر عدة ومزرعة الحيوانات. بالإضافة إلى إتقان مجموعة خاصة من microinjection المهارات اللازمة لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا بحقنه PN، الباحثين يجب أن نفهم فسيولوجية الإنجاب وسلوك الأنواع المستهدفة، لأنه يقدم كل أنواع فريدة من نوعها التحديات. على سبيل المثال، قد الأجنة الهامستر السوري الذهبي فريدة معالجة الاحتياجات في المختبر بتقنيات الحقن PN لم تكن ممكنة في هذه الأنواع حتى الاكتشافات الأخيرة من مجموعتنا. لدينا بروتوكول الحقن PN تعديل الأنواع، نجحنا في إنتاج العديد من خروج المغلوب الجينات (كو) و knockin الهامستر (كي)، التي استخدمت بنجاح للأمراض التي تصيب الإنسان النموذجي. هنا يمكننا وصف الإجراء حقن PN لإيصال المعقدة كريسبر/Cas9 إلى زيجوتيس الهامستر، وشروط التعامل مع الجنين، إجراءات نقل الأجنة، وتربية المطلوبة لإنتاج وراثيا تعديل الهامستر.

تتوقف فعالية البروتوكول هو موضح في إنتاج الهامستر المعدلة وراثيا على نتائج اثنين الخطوات الحاسمة التالية: معدل المواليد الإناث المستفيدة وعدد الجراء يعيش مع التعديلات الوراثية المقصود. معدل المواليد هو نتائج مباشرة لنوعية الجنين والمهارة للفرد أداء السندات الإذنية ال...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

حقن (PN) برونوكلير مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) ونظام البروتين-9 المرتبطة كريسبر نوكلاس (كريسبر/Cas9) طريقة ذات كفاءة عالية لإنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا. هنا، نحن تصف البروتوكول حقن PN مفصلة لإنتاج الجينات خروج المغلوب الهامستر مع نظام كريسبر/Cas9.

إنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا عن طريق الحقن برونوكلير من مجمع كريسبر/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

عن طريق الحقن ومحملة المخدرات Supramolecular هيدروجيل لحقن القسطرة المحلي في قلب خنزير

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

إنتاج وتوصيف والمحتملة استخدامات الأنسجة المهندسة-3D الإنسان المريء المخاطي نموذج

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

رصد في الوقت الحقيقي من بين الخلايا الصفراء حمض حيوية باستخدام حمض الصفراء الاستشعار القائمة على الحنق ترميز وراثيا

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

إنتاج الجسيمات النانوية المعدنية عن طريق نابض بالليزر في الاجتثاث في السوائل: أداة لدراسة خصائص مضادة للجراثيم من الجسيمات النانوية

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

إنتاج المواد الكيميائية من قبل<em&gt; كليبسيلا بنيومونياي</em&gt; استخدام الخيزران هدروليزيت كمادة وسيطة

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

هندسة Fluorescence 'الذهبي' بإدراج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول وتحليل البروتين الكتلي والأسفار

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection "روتوورم الذرة الغربية"، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، والأجنة لتحويل الخط، أو تحرير الجينوم كريسبر/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

التجميع السريع للبنى متعددة الجينات باستخدام استنساخ البوابة الذهبية المعيارية

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...