Name: production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af den nationale institutter for allergi og smitsomme sygdomme (NIAID) af National Institutes of Health under award nummer 1R41OD021979 (til ZW) og af en forskning tilskud fra næste generations BioGreen 21 Program, Republikken Korea, give nr. PJ01107704 (til ZW) og give nr. PJ01107703 (til IK). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health eller BioGreen 21. Vi takker Dr. Nikolas Robl redigeringsværktøjer håndskriftet.

Procedurerne i denne protokol godkendtes af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Utah State University (IACUC protokol: 2484). Hamstere bruges i denne protokol er voksne (6-10 uger gammel) LVG stamme gyldne syriske hamstere. Alle hamstere er opstaldet i vivarium på byens Bioinnovation, Utah State University. Stuetemperatur er beliggende på 23 ° C, luftfugtighed er fastsat til 40-50% og lys cyklus ligger 14L: 10D (lys: mørke). Når det er muligt, skal embryonet manipulation og surugical procedurer udf...

<ol>
	<li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease.">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li><li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds.">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li><li>Thomas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+as+a+permissive+immunocompetent+animal+model+for+the+study+of+oncolytic+adenovirus+vectors.">Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors.</a> Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).</li><li>Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Syrian+hamster+as+an+animal+model+for+oncolytic+adenovirus+vectors.">Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors.</a> Methods Mol Med. , 169-183 (2007).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever.">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li><li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters.">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li><li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis.">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li><li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum:+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies.">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li><li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome.">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li><li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR/Cas9+system.">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).</li><li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins:+pantothenate+stimulates+blastocyst+production.">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li></ol>

For at bedre udnytte potentialet i golden syriske hamstere som modeller for menneskelig sygdom, udviklede vi en PN injektion protokol for at levere en CRISPR/Cas9 komplekse at målrette hamster genom. PN injektion protokol optimerer flere nøglevariabler herunder embryo næringssubstrat, temperatur og bølgelængder af lys13. Der er også flere hamster-specifikke animalske håndtering procedurer, der skal følge til succesrig gennemførelse af genet målretning i hamster. For eksempel, har seksuel...

Den gyldne syriske hamster (Mesocricetus auratus) er en af de mest udbredte gnavere for biomedicinsk forskning. Ifølge det amerikanske Department of Agriculture, blev ca 100.000 hamstere brugt i USA i 2015, svarende til 13% af samlede laboratorium animalsk skik blandt de arter, der er omfattet af den animalsk velfærd opføre (http://www.aphis.usda.gov; adgang til Marts 10, 2017).
Hamster tilbyder flere fordele sammenlignet med andre gnavere i studiet af en række menneskelige sygdomme. For eksempel histopatologi af N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) induceret i bugspytkirtlen duktalt adenocarcinomer i hamster er svarende til menneskelige Pankreas tumorer, mens BOP behandling primært inducerer skjoldbruskkirtlen tumorer hos rotter og lunge og lever tumorer i mus1. Fordi hamstere er kun små gnavere fundet støtte replikering af adenovirus, er de også model valg for afprøvning af adenovirus-baserede oncolytic vektorer og anti-adenovirus narkotika2,3,4. Et andet eksempel hvori hamster model tilbyder en fordel frem for mus og rotter er i studiet af hyperlipidæmi. Mennesker og hamstere udviser store ligheder i lipid stofskifteveje og begge arter bærer genet kodning cholesteryl ester overførsel protein (CETP), som spiller en central rolle i lipid metabolismer, mens CETP er fraværende i mus og rotter5. Derudover udvikle hamstere hæmoragisk sygdom mere repræsentativt for den menneskelige manifestation efter udsættelse for Ebola virus6. Hamstere er også modeller af valg for at studere åreforkalkning7og mundtlige karcinomer8inflammatoriske myopatier9. Det har for nylig også påvist, at hamstere er meget modtagelige for Andes virusinfektion og udvikle hantavirus pulmonal syndrom-lignende sygdom, giver den kun gnaver model af Andes virus infektion10.
For at løse den udækket behov for nye genetiske dyremodeller for at studere de menneskelige sygdomme hvor ingen pålidelig lille gnaver model er tilgængelig, vi for nylig lykkedes at anvende ordningen for CRISPR/Cas9 til hamster og har produceret flere linjer af genetisk manipuleret hamstere11. Hamster zygotes er meget følsomme over for miljømæssige miljøer, således at PN injektion protokoller udviklet i andre arter er uegnede. Derfor, har vi udviklet en PN injektion protokol til hamster, der rummer de særlige krav til håndtering af hamster embryoner in vitro. Her, beskriver vi de detaljerede PN injektion metode bruger CRISPR/Cas9-system og den ledsagende foranstaltninger, fra forberedelse af enkelt guide RNA (sgRNA) til overførsel af injicerede embryoner til modtagerens hunner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B25640</td>
			<td>1 ug/ul (~6.1 uM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArtTM Precision Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A29377</td>
			<td>For sgRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from human serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td>For cultivation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-150</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>Galaxy 14S</td>
			<td>For embryo cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PB-7</td>
			<td>For making injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti-S</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1840</td>
			<td>Keep in dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877-2000IU</td>
			<td>For superovulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex

Pronuclear (PN) injektionsteknik blev først etableret i mus at indføre udenlandske genetiske materiale i pronuclei af én-celle stadium embryoner. Det indførte genetiske materiale kan integrere i den embryonale genom og generere transgene dyr med udenlandske genetiske oplysninger efter overførsel af de injicerede embryoner for at fremme mødre. Efter succesen i mus, PN injektion er blevet anvendt med succes i mange andre dyrearter. For nylig, PN injektion er blevet med held ansat at indføre reagenser med gen-ændring aktiviteter, som CRISPR/Cas9-systemet til at opnå lokationsspecifikke genetiske modifikationer i flere laboratorium og gård dyrearter. Ud over at beherske den særlige sæt af mikroinjektion færdigheder til at producere genetisk modificerede dyr ved PN injektion, skal forskere forstå reproduktion fysiologi og adfærd af målarter, fordi hver art præsenterer unikke udfordringer. For eksempel, gyldne syriske hamster embryoner har unikke håndtering af krav i vitro således at PN injektionsteknik ikke var muligt i denne art indtil de seneste gennembrud af vores gruppe. Med vores arter-modificerede PN injektion protokol lykkedes det producerer flere gen knockout (KO) og knockin (KI) hamstere, som har været anvendt med succes til model menneskelige sygdomme. Beskriver her vi PN injektion procedure til at levere CRISPR/Cas9 komplekse til zygotes af hamster, embryo håndtering betingelser, embryo transfer procedurer, og dyrehold kræves for at producere genetisk modificerede hamstere.

Effektiviteten af de beskrevne protokol i at producere genetisk modificerede hamstere afhænger af resultaterne af de følgende to kritiske trin: live fødselstallet af modtagerens hunner og antallet af levende unger med de påtænkte genetiske modifikationer. Live fødselstallet er en direkte resultater af embryo kvalitet og dygtighed af den enkelte udfører PN injektion og embryo transfer procedurer. For at sikre, at den udviklingsmæssige potentiale af manipulerede embryoner ikke er ko...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Pronuclear (PN) injektion af den grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) og CRISPR-forbundet protein-9 nukleasen (CRISPR/Cas9) system er en yderst effektiv metode til fremstilling af gensplejsede gyldne syriske hamstere. Heri, beskriver vi detaljeret PN injektion protokollen til produktion af genet knockout hamstere med CRISPR/Cas9-systemet.

Produktion af gensplejsede gyldne syriske hamstere af Pronuclear injektion af CRISPR/Cas9-komplekset

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injicerbar and Drug-loaded Supramolekylær Hydrogel for Local kateter injektion i Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering og potentielle anvendelse af en 3D-Tissue-manipuleret humant Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real Time Overvågning af intracellulære Bile Acid Dynamics Ved hjælp af en genetisk indkodede FRET-baserede Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Fremstilling af metal nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et værktøj til at studere de antibakterielle egenskaber ved nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produktion af kemikalier af<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Brug af bambushydrolysat som fødevare

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv Generation og redigering af Feeder-gratis IPSCs fra pancreas celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Gyldne' fluorescens af selektiv pres indarbejdelse af ikke-kanoniske aminosyrer og proteinanalyse af massespektrometri og fluorescens

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Mikroinjektion af Western majs-rodorm Diabrotica virgifera virgifera, embryoner for kønscelleoverførsel Transformation, eller CRISPR/Cas9 genom-redigering

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Hurtig samling af multigenkonstruktioner ved hjælp af modulær golden gate-kloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...