Name: production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של מכוני הבריאות הלאומיים תחת 1R41OD021979 מספר פרס (כדי ZW) ועל -ידי מענק מחקר של 21 BioGreen הדור הבא התוכנית, הרפובליקה של קוריאה, להעניק. לא. PJ01107704 (כדי ZW) ולהעניק לא. PJ01107703 (כדי IK). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נוף הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים או BioGreen 21. אנו מודים ד ר ניקולס Robl על עריכת כתב היד.

בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת יוטה (פרוטוקול IACUC: 2484). אוגרים המשמשים פרוטוקול זה הם מבוגרים (מגיל 6-10 שבועות) LVG זן הזהב אוגרים סוריים. אוגרים כל מלון את ביבר במרכז Bioinnovation, אוניברסיטת מדינת יוטה. בטמפרטורת החדר מוגדר ...

<ol>
	<li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease.">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li><li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds.">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li><li>Thomas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+as+a+permissive+immunocompetent+animal+model+for+the+study+of+oncolytic+adenovirus+vectors.">Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors.</a> Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).</li><li>Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Syrian+hamster+as+an+animal+model+for+oncolytic+adenovirus+vectors.">Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors.</a> Methods Mol Med. , 169-183 (2007).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever.">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li><li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters.">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li><li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis.">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li><li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum:+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies.">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li><li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome.">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li><li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR/Cas9+system.">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).</li><li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins:+pantothenate+stimulates+blastocyst+production.">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li></ol>

כדאי לנצל את הפוטנציאל של אוגרים סוריים הזהב כמודלים של מחלות אנושיות, פיתחנו פרוטוקול הזרקת PN להעברת של CRISPR/Cas9 מורכבים כדי למקד את הגנום אוגר. פרוטוקול הזרקת PN מיטוב מספר משתני מפתח לרבות העובר תרבות בינוני, טמפרטורה, אורכי גל של אור13. ישנם גם מספר הליכים ספציפיים אוגר לטיפול ...

האוגר הסורי הזהב (אם לדייק Mesocricetus) הוא אחד המכרסמים הנפוצה ביותר למחקר ביורפואי. על-פי מחלקת החקלאות של ארצות הברית, כ-100,000 אוגרים שימשו בארצות הברית בשנת 2015, המייצג 13% השימוש בבעלי חיים המעבדה הכולל בין המינים מכוסה על ידי חוק רווחת בעלי חיים (http://www.aphis.usda.gov; לגשת מרץ 10, 2017).
האוגר מציע כמה יתרונות על פני מכרסמים אחרים במחקר של מספר מחלות אנושיות. לדוגמה, אדנוקרצינומה בלבלב histopathology של N-nitrosobis(2-oxopropyl) אמין (BOP) המושרה ductal ב אוגר דומה גידולים בלבלב האנושי, בעוד הטיפול בופ מעוררת בעיקר גידולי בלוטת התריס חולדות, ריאות, גידולים בכבד עכברים1. בגלל אוגרים למכרסמים קטנים בלבד נמצאו כדי לתמוך את השכפול של adenoviruses, הם גם המודל של בחירה עבור בדיקות oncolytic המבוסס על אדנו וקטורים, אנטי-אדנו סמים-2,-3,-4. דוגמה נוספת שבה המודל אוגר מציע יתרון על עכברים וחולדות היא במחקר של היפרליפידמיה. אוגרים ובני להפגין קווי דמיון גדול בין משעולים חילוף החומרים של השומנים, בשני המינים הם נשאים של הגן קידוד cholesteryl אסתר העברה חלבון (CETP), אשר ממלא תפקיד מרכזי השומנים שיטות ההזנה, בעוד CETP הוא נעדר עכברים, חולדות5. בנוסף, אוגרים לפתח יותר נציג של הביטוי האנושי בעקבות חשיפה וירוס האבולה6hemorrhagic המחלה. אוגרים הם גם הדגמים של בחירה עבור הלומדים טרשת עורקים7, קרצינומות אוראלי8ו דלקתיים myopathies9. . לאחרונה, זה גם הוכח כי אוגרים הם רגישים מאוד זיהום בנגיף האנדים, לפתח מחלות כמו תסמונת ריאתי הנטא וירוס, מתן המודל מכרסמים רק Andes וירוס זיהום10.
כדי לענות על הצורך קיימים מודלים גנטי הרומן ללמוד את מחלות אנושיות איפה לא אמין דגם מכרסם קטן זמין, לאחרונה הצליחו החלה מערכת CRISPR/Cas9 על האוגר ואנו יצרו מספר שורות גנטית מתוכנן אוגרים11. אוגר מופרות רגישים מאוד milieus סביבתי כזה כי הפרוטוקולים הזרקת PN פותח במינים אחרים מתאימים למחייה. לכן, פיתחנו פרוטוקול הזרקת PN עבור אוגר התואם את דרישות מיוחדות לטיפול אוגר העוברים בתוך חוץ גופית. כאן, אנו מתארים את ההליך הזרקת PN מפורט באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 והצעדים הנלווה, משלב הכנת מדריך בודד RNA (sgRNA) העברת העוברים מוזרק לתוך נקבות הנמען.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B25640</td>
			<td>1 ug/ul (~6.1 uM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArtTM Precision Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A29377</td>
			<td>For sgRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from human serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td>For cultivation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-150</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>Galaxy 14S</td>
			<td>For embryo cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PB-7</td>
			<td>For making injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti-S</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1840</td>
			<td>Keep in dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877-2000IU</td>
			<td>For superovulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex

טכניקת ההזרקה (PN) pronuclear הוקם לראשונה בעכברים להציג חומרים גנטיים זרים לתוך pronuclei של שלב אחד-תא עוברי. החומר הגנטי הציג עשויים לשלב הגנום העוברי וצור הטרנסגניים חיות עם זרים מידע גנטי בעקבות העברת העוברים מוזרק לטפח אימהות. בעקבות ההצלחה בעכברים, הזרקת PN הוחל בהצלחה במינים בעלי חיים רבים אחרים. לאחרונה, הזרקת PN כבר בהצלחה מועסקים להציג ריאגנטים עם שינוי גנטי פעילויות, כגון מערכת CRISPR/Cas9, כדי להשיג שינויים בייעודי לאתר גנטית במעבדה מספר החווה מיני בעלי חיים. בנוסף מאסטרינג בערכה מיוחדת של מיומנויות microinjection כדי לייצר חיים מהונדסים בזריקה PN, חוקרים חייב להבין את הפיזיולוגיה של רבייה וההתנהגות של המין היעד, בגלל כל מיני מתנות ייחודיות אתגרים. לדוגמה, אוגר סורי זהוב עוברי יש ייחודי טיפול בדרישות במבחנה כזאת PN הזרקת טכניקות היו אפשריים במין זה עד פריצות דרך זה התבצעה על ידי הקבוצה שלנו. עם מינים-השתנה PN הזרקת הפרוטוקול שלנו הצלחנו לייצר מספר נוקאאוט גנטי (KO) ו knockin אוגרים (KI), אשר שימשו בהצלחה מודל מחלות אנושיות. כאן נתאר את הליך הזרקת PN מוסר את CRISPR/Cas9 מורכבים מופרות של האוגר, העובר טיפול בתנאים, נהלי ההעברה העובר ולאחר גידול הדרושה להפקת גנטית שונה אוגרים.

היעילות של הפרוטוקול המתואר בהפקת אוגרים מהונדסים תלוי התוצאות של שני קריטי בשלבים הבאים: live הילודה של נקבות הנמענים ואת מספר הגורים בשידור חי עם השינויים הגנטי המיועד. קצב הילודה live הוא של תוצאות ישירות של איכות העובר את המיומנות של הפרט מבצע את הזרקת PN העובר נהלי ההעבר?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Pronuclear (PN) הזרקה של באשכולות באופן קבוע interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR), מערכת CRISPR-הקשורים חלבון-9 נוקלאז (CRISPR/Cas9) היא שיטה יעילה במיוחד להפקת מהונדס גנטית אוגרים סוריים הזהב. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט של הזרקת PN לייצור של אוגרים נוקאאוט גנטי עם מערכת CRISPR/Cas9.

הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת Pronuclear של המתחם CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

מולקולריים Hydrogel זריקות וטעוני תרופות להזרקה מקומית צנתר לתוך לב החזיר

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

ייצור של חלקיקי מתכת על ידי פעימה לייזר ablation בנוזלים: כלי לחקר מאפיינים אנטיבקטריאליים של חלקיקים

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

ייצור כימיקלים לפי<em&gt; קלבסילה דלקת ריאות</em&gt; באמצעות הידרוליזה במבוק כמו זינה

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...