Name: production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

この出版物で報告された研究は、国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID) の健康の国民の協会 (ZW) に受賞番号 1R41OD021979 の下で、次世代 BioGreen 21 からの研究助成金にサポートされていたプログラムは、韓国の許可なし。PJ01107704 (ZW) に no を与える。(IK) を PJ01107703。内容は著者の責任と BioGreen 21 の国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。博士ニコラス Robl は、原稿の編集を感謝いたします。

このプロトコルで説明する手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ユタ州立大学によって承認された (IACUC プロトコル: 2484)。このプロトコルで使われるハムスターが大人 (6-10 週齢) LVG ひずみシリアのハムスター。すべてのハムスターは、ユタ州立大学 Bioinnovation センターでビバリウムで収容されます。部屋の温度は 23 ° C に設定されて、湿度が 40-50% に設定されて、ライト サイクルの...

<ol>
	<li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease.">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li><li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds.">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li><li>Thomas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+as+a+permissive+immunocompetent+animal+model+for+the+study+of+oncolytic+adenovirus+vectors.">Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors.</a> Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).</li><li>Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Syrian+hamster+as+an+animal+model+for+oncolytic+adenovirus+vectors.">Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors.</a> Methods Mol Med. , 169-183 (2007).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever.">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li><li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters.">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li><li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis.">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li><li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum:+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies.">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li><li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome.">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li><li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR/Cas9+system.">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).</li><li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins:+pantothenate+stimulates+blastocyst+production.">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li></ol>

良いひと疾患のモデルとしてシリアのハムスターの可能性を悪用する、我々 は、CRISPR/Cas9 複雑なハムスターのゲノムを対象とするを提供するため PN 注入プロトコルを開発しました。PN 注入プロトコルには、胚培養培地、温度、光13の波長などいくつかのキーの変数が最適化されます。また、ハムスターの遺伝子ターゲティングを正常に実施するために従う必要がありますい...

黄金のシリアのハムスター (ん) は、生物医学研究のための最も広く使用されている齧歯動物のひとつです。米国農務省によると約 100,000 ハムスターが動物福祉法 (http://www.aphis.usda.gov; アクセスで覆われて種総研究所動物使用量の 13% を表す、2015 年にはアメリカ合衆国で使用されました。2017 年 3 月 10 日)。
ハムスターは、人間の病気の多数の研究では他の齧歯動物をいくつかの利点を提供しています。BOP 治療は主にラットおよび肺の甲状腺腫瘍、肝腫瘍を誘発するたとえば、ハムスターで誘導される N nitrosobis(2-oxopropyl) アミン (BOP) の病理膵膵管癌は人間の膵臓の腫瘍のようマウス1。ハムスターはアデノ ウィルスのレプリケーションをサポートする唯一の小さい齧歯動物であるため、またアデノ ウイルスによる腫瘍溶解性ベクトルおよび抗アデノ ウイルス薬2,3,4のテストに最適なモデルです。高脂血症の研究では、前記のハムスター モデルはマウスおよびラット上の優位性を提供しています別の例です。人間やハムスターが脂質代謝経路で偉大な類似を表わすし、両種コレステリル エステル転送タンパク (CETP)、脂質代謝、CETP が不在のマウスとラットの5において中心的な役割を担う遺伝子を運ぶ。また、ハムスターはエボラ ウイルス6への露出に続く人間の症状の代表的な出血性疾患を開発します。ハムスターは、また動脈硬化症7、口腔癌8、および炎症性 myopathies9の勉強に最適なモデルです。最近では、それがハムスターをアンデス ウイルスに高い感受性がアンデス ウイルス感染症10のみ齧歯動物モデルを提供するハンタ ウイルス肺症候群のような疾患を発症、実証もされています。
我々 は最近、ハムスターに CRISPR/Cas9 システムを適用することに成功しているし、遺伝子のいくつかの行を生産している信頼性の高い小さな齧歯動物モデルがない利用可能な人間の病気を研究する新しい遺伝的動物モデルの満たされていない必要性に対処するためハムスター11を設計されています。ハムスターの受精卵は、他の種で開発された PN の注入のプロトコルが適してなど環境調査に非常に敏感です。したがって、我々 はハムスター ハムスター胚体外を処理するための特別な要件に対応するため PN 注入プロトコルを開発しました。ここでは、CRISPR/Cas9 システムと受信者の女性に挿入された胚の転送を 1 つのガイド RNA (sgRNA) の準備から、付属の手順を使用して詳細な PN の注入手順をについて説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B25640</td>
			<td>1 ug/ul (~6.1 uM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArtTM Precision Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A29377</td>
			<td>For sgRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from human serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td>For cultivation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-150</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>Galaxy 14S</td>
			<td>For embryo cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PB-7</td>
			<td>For making injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti-S</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1840</td>
			<td>Keep in dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877-2000IU</td>
			<td>For superovulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex

前核 (PN) 注入法 1 セル段階の胚の前核に外国の遺伝物質を導入するマウスで設立。導入された遺伝物質が胚のゲノムに統合し、次の母親を促進する挿入された胚の転送外国の遺伝情報を持つトランスジェニック動物を生成します。マウスで成功、PN の注入は、他の多くの動物種で正常に適用されています。最近では、PN の注入は正常に遺伝子変更と試薬を紹介に雇われているいくつかの研究室でサイト固有の遺伝的改変を達成し、農場の動物種の CRISPR/Cas9 システムなどの活動。PN 注入による遺伝子改変動物を生産するマイクロインジェクション技術の特別なセットを習得しただけでなく研究者を理解しなければならない繁殖生理学と対象種の動作それぞれの種プレゼント ユニークなので課題。たとえば、シリアのハムスター胚がユニークな PN 注入技術では不可能だったこの種当社グループによる最近の進歩までその体外要件の処理します。私たち種変更 PN 注入プロトコルで、いくつかの遺伝子ノックアウト (KO) の生産でノック (KI) ハムスターは、人間の病気に正常に使用されている成功しました。ここでハムスター、胚の処理条件、胚転送プロシージャの受精卵に CRISPR/Cas9 複雑なを提供するため PN 注入手順を説明、遺伝子を生成するために必要な畜産変更ハムスター。

遺伝子組み換えのハムスターの生産に記載されているプロトコルの効率によって異なります次の 2 つの重要なステップの結果: 受信者の女性と目的遺伝子の組み換えライブ仔犬の数の出生率。出生率は胚の質の直接結果、PN 注入および胚転送プロシージャを実行する個々 のスキル。操作の胚の発達の可能性が損なわれないように、細心の注意は、ハムスターの胚の...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

クラスター化の前核 (PN) 注射は定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) を空間、CRISPR 関連タンパク質 9 ヌクレアーゼ (CRISPR/Cas9) システムは非常に効率的な遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの製造方法。ここで、遺伝子ノックアウト ハムスター CRISPR/Cas9 システムの生産のための詳細な PN 注入プロトコルについて述べる。

CRISPR/Cas9 複合体の前核注入による遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの生産

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

豚の心臓にローカルカテーテルを注入するための注射や薬物を装填した超分子ヒドロゲル

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

遺伝的にコードされたFRETベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

液体中のパルスレーザアブレーションによる金属ナノ粒子の生成：ナノ粒子の抗菌特性を調べるためのツール

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

化学薬品の製造<em&gt;クレブシエラ・ニューモニエ</em&gt; Bamboo加水分解物を原料として使用する

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

非正規のアミノ酸の選択圧による 'ゴールデン' 蛍光と質量分析法と蛍光タンパク質解析工学

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

モジュラーゴールデンゲートクローニングを用いた多遺伝子構造の迅速な組み立て

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

CRISPR/Cas9 複合体の前核注入による遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの生産

CRISPR/Cas9 複合体の前核注入による遺伝子組み換えゴールデンハムスターの生産