Name: production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Institutes of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID) av National Institutes of Health under prisen nummer 1R41OD021979 (å ZW) og et forskningsstipend fra neste generasjons BioGreen 21 Programmet, Sør-Korea, gir ingen. PJ01107704 (til ZW) og nei. PJ01107703 (til IK). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av National Institutes of Health eller BioGreen 21. Vi takker Dr. Nikolas Robl for redigering manuskriptet.

Fremgangsmåtene i denne protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Utah State University (IACUC protokollen: 2484). Hamsters brukes i denne protokollen er voksen (6-10 uker gammel) LVG belastning golden syrer hamsters. Alle hamstere ligger i vivarium i Bioinnovation sentrum, Utah State University. Romtemperatur ligger på 23 ° C, luftfuktighet ligger 40-50% og lyset sykle ligger 14L: 10D (lys: dark). Mulig embryoet manipulasjon og surugical prosedyrer bør utføres med sterilt ...

<ol>
	<li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease.">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li><li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds.">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li><li>Thomas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+as+a+permissive+immunocompetent+animal+model+for+the+study+of+oncolytic+adenovirus+vectors.">Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors.</a> Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).</li><li>Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Syrian+hamster+as+an+animal+model+for+oncolytic+adenovirus+vectors.">Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors.</a> Methods Mol Med. , 169-183 (2007).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever.">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li><li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters.">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li><li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis.">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li><li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum:+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies.">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li><li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome.">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li><li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR/Cas9+system.">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).</li><li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins:+pantothenate+stimulates+blastocyst+production.">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li></ol>

Bedre utnytte potensialet i golden syrer hamsters som modeller for menneskelig sykdom, utviklet vi en PN injeksjon protokoll for å levere en CRISPR/Cas9 komplekse målrettingsland hamster genomet. PN injeksjon protokollen optimaliserer flere viktige variabler inkludert embryoet kultur medium, temperatur og bølgelengder av lys13. Det er også flere hamster-spesifikke dyr håndteringsprosedyrer må følge for å kunne gjennomføre genet målretting i hamster. For eksempel har seksuelt modnet kvinn...

Golden Syreren hamster (Mesocricetus auratus) er en av de mest brukte gnagere for biomedisinsk forskning. Ifølge US Department of Agriculture, ble ca 100.000 hamstere brukt i USA i 2015, som representerer 13% av totale laboratorium dyr bruk blant artene som omfattes av det dyr velferd gjerning (http://www.aphis.usda.gov; tilgjengelig 10 mars 2017).
Hamster tilbyr flere fordeler sammenlignet med annet Red i studiet av en rekke menneskelige sykdommer. For eksempel histopatologi av N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) indusert bukspyttkjertelen ductal adenocarcinomas i hamster ligner menneskelige bukspyttkjertelen svulster, mens BOP behandling hovedsakelig induserer skjoldbruskkjertelen svulster i rotter og lunge og leverskader svulster i mus1. Fordi hamsters er bare små gnagere grunnlegge for å oppbacking replikering av adenoviruses, er de også modell av valget for adenovirus-basert kan vektorer og anti-adenovirus narkotika2,3,4. Et annet eksempel hvor hamster modellen tilbyr en fordel over mus og rotter er i studiet av hyperlipidemi. Mennesker og hamstere viser stor likheter i lipid metabolske veier og begge arter bærer genet koding cholesteryl ester overføring protein (CETP), som spiller en sentral rolle i lipid metabolisms, mens CETP er fraværende i mus og rotter5. I tillegg utvikle hamstere hemorrhagic sykdommen mer representative for menneskelig manifestasjonen etter eksponering for Ebola-viruset6. Hamsters er også modeller av valget for å studere aterosklerose7, muntlig kreftsvulster8og inflammatoriske myopathies9. Nylig har det også vært vist at hamsters er svært utsatt for Andes virusinfeksjon og utvikle hantavirus lunge syndrom-lignende sykdom, gir bare gnager modell av Andes virus infeksjon10.
For å løse udekkede behov for romanen genetisk dyremodeller å studere menneskelige sykdommer der ingen pålitelig små gnagere modell er tilgjengelig, vi nylig har lyktes i å bruke CRISPR/Cas9 systemet til hamster og har produsert flere linjer med genetisk konstruert hamstere11. Hamster zygotes er svært følsom for miljømessige miljøer slik at PN injeksjon protokoller utviklet i andre arter er uegnet. Derfor utviklet vi en PN injeksjon protokoll for hamster som er tilpasset de spesielle kravene for håndtering av hamster embryo i vitro. Her beskriver vi detaljerte PN injeksjon prosedyren bruker CRISPR/Cas9 systemet og følger trinnene, utarbeidelse av enkelt støttelinje RNA (sgRNA) til å overføre injisert embryo i mottakerens kvinner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B25640</td>
			<td>1 ug/ul (~6.1 uM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArtTM Precision Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A29377</td>
			<td>For sgRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from human serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td>For cultivation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-150</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>Galaxy 14S</td>
			<td>For embryo cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PB-7</td>
			<td>For making injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti-S</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1840</td>
			<td>Keep in dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877-2000IU</td>
			<td>For superovulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex

Pronuclear (PN) injeksjon teknikken ble først etablert i mus å innføre genetisk fremmedlegemer i pronuclei av en celle scenen embryo. Introdusert arvestoffet kan integrere embryonale genomet og generere transgene dyr med utenlandske genetisk informasjon etter overføring av de injiserte embryoene å fremme mødre. Etter suksessen i mus, PN injeksjon er brukt med hell i mange andre dyrearter. Nylig PN injeksjon har vært ansatt å innføre reagenser med endring av genet aktiviteter, for eksempel CRISPR/Cas9 system, å oppnå områdespesifikke genetiske modifikasjoner i flere laboratorium, og gården dyrearter. I tillegg til mestring spesielle settet av microinjection ferdigheter å produsere genmodifiserte dyr av PN injeksjon, må forskere forstå reproduksjon fysiologi og atferd av målet artene, fordi hver art presenterer unike utfordringer. For eksempel golden Syrer hamster embryoer har unik håndtering krav i vitro slik at PN-injeksjon teknikker ikke var mulig i denne arten til siste gjennombrudd av vår gruppe. Med våre arter endret PN injeksjon protokollen, har vi lykkes i produksjon flere genet knockout (KO) og knockin (KI) hamsters, som har vært brukt med hell modell menneskelige sykdommer. Beskriver her vi PN injeksjon prosedyren for å levere CRISPR/Cas9 kompleks til zygotes hamster, fosteret håndtering forhold, fosteret overføring prosedyrer, og dyrehold kreves for å produsere genetisk endret hamstere.

Effektiviteten av beskrevet protokollen produsere genmodifiserte hamstere avhenger av utfallet av følgende to viktige trinn: live fødselsrate av mottakeren kvinner og antall live pups med de tiltenkte genetiske modifikasjonene. Live fødselen er et direkte resultat av embryoet kvalitet og dyktighet av enkelt PN injeksjon og embryo overføring prosedyrer. For å sikre at den utviklingsmessige potensialet av manipulert embryo ikke er i fare, er stor forsiktighet nødvendig under i vit...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Pronuclear (PN) injeksjon av de klynget regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) og CRISPR-assosiert protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) er en svært effektiv metode for å produsere genmodifiserte golden syrer hamsters. Her beskriver vi detaljerte PN injeksjon protokollen for produksjon av genet knockout hamstere med CRISPR/Cas9-systemet.

Produksjon av genmodifiserte Golden syrer Hamsters ved Pronuclear injeksjon av CRISPR/Cas9 komplekset

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injeksjon and Drug lastet Supramolecular hydrogel for Lokal kateter Injeksjon i Pig Hjerte

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produksjon, karakterisering og potensielle bruk av en 3D Tissue-konstruert Menneskelig Esophageal slimhinnene Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Sanntidsovervåking av Intracellulær gallesyre Dynamics Ved hjelp av en genetisk kodet FRET baserte gallesyre Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produksjon av metall nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et verktøy for å studere de antibakterielle egenskapene til nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produksjon av kjemikalier av<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bruke bambushydrolysat som råstoff

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv generasjon og redigering av mater-gratis IPSCs fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

'Golden' fluorescens av seleksjonspress innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer og proteiner analyse av massespektrometri og fluorescens

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Western mais Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryo for Germline transformasjon eller CRISPR/Cas9 genomet redigering

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteksjon av Endotoxin i Nano-formuleringer bruker Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Rask montering av multigenkonstruksjoner ved hjelp av modulær golden gate-kloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...