Name: production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00
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Investigación en esta publicación fue apoyada por los institutos nacionales de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número 1R41OD021979 (a ZW) y por una beca de investigación de última generación BioGreen 21 Programa, República de Corea, subsidio no. PJ01107704 (a ZW) y subsidio no. PJ01107703 (a IK). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud o BioGreen 21. Agradecemos a Dr. Nikolas Robl para editar el manuscrito.

Los procedimientos descritos en este protocolo fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de Utah State University (protocolo IACUC: 2484). Hamsters en este protocolo son el adultos (6-10 semanas de edad) LVG cepa hámsters sirios dorados. Los hámsteres están alojados en el vivero en el centro de Bioinnovation, Utah State University. Temperatura ambiente se encuentra a 23 ° C, humedad se establece en 40-50%, y se establece el ciclo de luz 14:00 (luz: oscuridad). Siempre que sea posible,...

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	<li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease.">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li><li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds.">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li><li>Thomas, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever.">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li><li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters.">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li><li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis.">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li><li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum:+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies.">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li><li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome.">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li><li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR/Cas9+system.">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).</li><li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins:+pantothenate+stimulates+blastocyst+production.">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li></ol>

Para aprovechar mejor el potencial de hámsters sirios dorados como modelos de enfermedades humanas, hemos desarrollado un protocolo de inyección de PN para entregar un CRISPR/Cas9 complejo para el genoma de hámster. El protocolo de inyección PN optimiza varias variables claves, incluyendo el medio de cultivo de embriones, la temperatura y longitudes de onda de luz13. También existen varios procedimientos de manejo de animales hamster específicos que deben seguir para la realización con éxi...

El hámster sirio dorado (Mesocricetus auratus) es uno de los roedores más ampliamente utilizados para la investigación biomédica. Según el Departamento de agricultura de Estados Unidos, se utilizaron hámsters aproximadamente 100.000 en los Estados Unidos en 2015, representando el 13% de uso animal, laboratorio total entre las especies cubiertas por la ley de Bienestar Animal (http://www.aphis.usda.gov; acceso 10 de marzo de 2017).
El hámster ofrece varias ventajas sobre otros roedores en el estudio de un número de enfermedades humanas. Por ejemplo, los adenocarcinomas ductal pancreático histopatología de amina N-nitrosobis(2-oxopropyl) (BOP) inducida en hámster es similar a los tumores pancreáticos humanos, BOP tratamiento principalmente induce tumores de la glándula de tiroides en ratas y de pulmón y tumores del hígado en ratones1. Porque los hámsteres son lo solamente pequeño roedor encontrado para apoyar la replicación del adenovirus, son también el modelo de elección para las pruebas de vectores basados en adenovirus oncolíticos y drogas contra adenovirus2,3,4. Otro ejemplo en donde el modelo de hámster ofrece una ventaja sobre las ratas y ratones es en el estudio de la hiperlipidemia. Los seres humanos y hámsters presentan grandes semejanzas en vías metabólicas de lípidos y ambas especies llevan el gen que codifica la acumulación de colesteril éster transferencia proteína (CETP), que desempeña un papel central en lípido metabolismo, mientras que el CETP está ausente en los ratones y ratas5. Además, hámsteres desarrollan enfermedad hemorrágica más representativa de la manifestación humana después de la exposición al virus de Ebola6. Hámsters son también los modelos de elección para el estudio de ateroesclerosis7, carcinomas orales8y9de Miopatías inflamatorias. Recientemente, también ha sido demostrado que hámsteres son altamente susceptibles a la infección del virus Andes y hantavirus pulmonar síndrome-como enfermedad, proporcionando el modelo sólo roedor de los Andes virus infección10.
Para abordar la necesidad insatisfecha de novela genéticas modelos animales estudiar las enfermedades humanas donde no está disponible confiable modelo roedor pequeño, recientemente han tenido éxito en la aplicación del sistema CRISPR/Cas9 para el hámster y han producido varias líneas de genética Ingeniería de hámsteres11. Cigotos de hámster son muy sensibles a medios ambientales que los protocolos de inyección PN desarrollados en otras especies no son adecuados. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo de inyección de PN para el hámster que se adapta a los requisitos especiales para la manipulación de embriones de hámster in vitro. Aquí, describimos el procedimiento de inyección PN detallado utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y las medidas de acompañamiento, desde la preparación del guía solo RNA (sgRNA) para la transferencia de embriones inyectados en hembras receptoras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B25640</td>
			<td>1 ug/ul (~6.1 uM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArtTM Precision Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A29377</td>
			<td>For sgRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from human serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td>For cultivation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-150</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>Galaxy 14S</td>
			<td>For embryo cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PB-7</td>
			<td>For making injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti-S</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1840</td>
			<td>Keep in dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877-2000IU</td>
			<td>For superovulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex

La técnica de inyección pronuclear (PN) fue establecida en ratones para introducir material genético extraño en los pronúcleos de embriones en estadío de una célula. El material genético introducido puede integrar en el genoma embrionario y generar animales transgénicos con información genética extranjera después de transferencia de los embriones inyectados para favorecer a las madres. Tras el éxito en ratones, inyección de PN se ha aplicado con éxito en muchas otras especies animales. Recientemente, inyección de PN se ha empleado con éxito para introducir reactivos gene-modificar actividades, tales como el sistema CRISPR/Cas9, para lograr modificaciones genéticas específicas en varios laboratorios y especies animales de la granja. Además de dominar el conjunto especial de microinyección habilidades para producir animales genéticamente modificados mediante la inyección de PN, los investigadores deben entender la fisiología de la reproducción y el comportamiento de las especies objetivo, debido a que cada especie presenta único desafíos. Por ejemplo, embriones de hámster sirio dorado tienen único manejo requisitos en vitro que técnicas de inyección de PN no fueron posibles en esta especie hasta descubrimientos recientes de nuestro grupo. Con nuestro protocolo de inyección de PN de especies modificadas, hemos tenido éxito en producir varios knockout del gen (KO) y knockin hámsteres (KI), que se han utilizado con éxito para enfermedades humanas modelo. Aquí describimos el procedimiento de inyección de PN para entregar el CRISPR/Cas9 complejo a los cigotos del hámster, condiciones de manejo de embriones, procedimientos de transferencia de embrión, y cría necesaria para producir genéticamente modificado hámsteres.

La eficiencia del protocolo descrito en la producción de transgénicos hamsters depende de los resultados de los siguientes dos pasos críticos: la tasa de nacidos vivos de hembras receptoras y del número de cachorros vivos con el previsto modificaciones genéticas. La tasa de nacidos vivos es resultado directo de la calidad del embrión y la habilidad de la persona realizando la inyección de PN y procedimientos de transferencia de embrión. Para asegurarse de que no se comprometa el p...

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Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Inyección pronuclear de (PN) del cluster regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y sistema CRISPR asociados 9 proteína nucleasa (CRISPR/Cas9) es un método altamente eficiente para la producción de transgénicos hámsters sirios dorados. Adjunto, describimos el protocolo detallado de la inyección del PN para la producción de hamsters de gene knockout con el sistema CRISPR/Cas9.

Producción de hámsters sirios dorados genéticamente por inyección Pronuclear del complejo CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Un supramolecular hidrogel inyectable de Drogas y cargadas para Inyección local catéter en el corazón de cerdo

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Investigación

Bioingeniería

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Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

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Monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar Dinámica El uso de un sensor de ácido biliar basada FRET-codificados genéticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

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