Name: production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av de nationella institut för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID) av det nationella Institutes of Health under award nummer 1R41OD021979 (till ZW) och ett forskningsanslag från nästa generations BioGreen 21 Program, Republiken Korea, bevilja nr. PJ01107704 (till ZW) och bevilja nr. PJ01107703 (till IK). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health eller BioGreen 21. Vi tackar Dr. Nikolas Robl för redigering manuskriptet.

Procedurerna som beskrivs i detta protokoll godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) från Utah State University (IACUC protokoll: 2484). Hamstrar som används i detta protokoll är vuxen (6-10 veckors ålder) LVG stam gyllene syriska hamstrar. Alla hamstrar är inrymda i ett vivarium på Bioinnovation center, Utah State University. Rumstemperatur ligger vid 23 ° C och luftfuktigheten ligger på 40-50% ljus cykel ligger 14L: 10D (ljus: mörk). Om möjligt bör embryo manipulation o...

<ol>
	<li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease.">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li><li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds.">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li><li>Thomas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+as+a+permissive+immunocompetent+animal+model+for+the+study+of+oncolytic+adenovirus+vectors.">Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors.</a> Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).</li><li>Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Syrian+hamster+as+an+animal+model+for+oncolytic+adenovirus+vectors.">Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors.</a> Methods Mol Med. , 169-183 (2007).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever.">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li><li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters.">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li><li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis.">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li><li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum:+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies.">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li><li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome.">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li><li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR/Cas9+system.">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).</li><li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins:+pantothenate+stimulates+blastocyst+production.">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li><li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes.">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li></ol>

För att bättre utnyttja möjligheter som gyllene syriska hamstrar som modeller för humana sjukdomar, utvecklade vi ett PN injektion protokoll för att leverera en CRISPR/Cas9 komplexa för att rikta hamster genomet. PN injektion protokollet optimerar flera viktiga variabler inklusive embryo odlingsmedium, temperatur och våglängder av ljus13. Det finns också flera hamster-specifika djurhantering förfaranden som måste följa för att framgångsrikt bedriva gen inriktning i hamster. Exempelvi...

Den gyllengula syriska hamstern (Mesocricetus auratus) är en av de mest använda gnagarna för biomedicinsk forskning. Enligt US Department of Agriculture användes ungefärligt 100.000 hamstrar i USA under 2015, vilket motsvarar 13% av totala laboratorium djur användning bland de arter som omfattas av djurskyddslagen (http://www.aphis.usda.gov; nås 10 mars 2017).
Hamster erbjuder flera fördelar jämfört med andra gnagare i studien av ett antal mänskliga sjukdomar. Exempelvis de histopatologi N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) inducerad pankreas duktal adenokarcinom i hamster är liknande till människors Pankreastumör, medan BOP behandling främst inducerar sköldkörteln tumörer hos råttor och lung och levertumörer hos möss1. Eftersom hamstrar är endast små gnagare hittade för att stödja replikering av adenoviruses, är de också modellen av val för att testa adenovirus-baserade onkolytisk vektorer och anti adenovirus droger2,3,4. Ett annat exempel vari hamster modellen erbjuder en fördel över möss och råttor är i studien av hyperlipidemi. Människor och hamstrar uppvisar stora likheter i lipid metaboliska vägar och båda arter bära den gen som kodar cholesteryl ester transfer protein (CETP), som spelar en central roll i lipid metabolismerna, medan CETP är frånvarande i möss och råttor5. Dessutom utveckla hamstrar hemorragisk sjukdom mer representativt av den mänskliga manifestation efter exponering för Ebola virus6. Hamstrar är också modeller av val för att studera ateroskleros7, muntliga carcinom8och inflammatoriska myopatier9. Nyligen har visats det också att hamstrar är mycket mottagliga för Anderna virusinfektion och utveckla hantavirus pulmonella syndrom-liknande sjukdom, ger den endast gnagare modellen av Anderna virus infektion10.
För att lösa otillfredsställda behov av nya genetiska djurmodeller studera de mänskliga sjukdomar där ingen pålitlig liten gnagare modell är tillgängliga, vi nyligen lyckats tillämpar CRISPR/Cas9 systemet till hamstern och har producerat flera rader av genetiskt bakåtkompilerade hamstrar11. Hamster zygoter är mycket känsliga för miljömässiga miljöer så att de PN injektion protokoll som utvecklats i andra arter är olämpliga. Därför utvecklade vi en PN injektion protokoll för hamster som rymmer de särskilda krav för hantering av hamster embryon in vitro. Här beskriver vi detaljerad PN injektionsproceduren med CRISPR/Cas9 systemet och medföljande stegen, från beredning av enda guide RNA (sgRNA) till överföringen av injicerade embryon till mottagarens honor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cas9</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B25640</td>
			<td>1 ug/ul (~6.1 uM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArtTM Precision Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A29377</td>
			<td>For sgRNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from human serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td>For cultivation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NI-150</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>Galaxy 14S</td>
			<td>For embryo cultivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PB-7</td>
			<td>For making injection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti-S</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td>For embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1840</td>
			<td>Keep in dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4877-2000IU</td>
			<td>For superovulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of genetically engineered golden syrian hamsters by pronuclear injection of the crispr/cas9 complex

Den pronukleär (PN) injektionstekniken fastställdes först hos möss att införa främmande genetisk material i pronuclei one-cellstadie embryon. Det införda genetiska materialet kan integrera i embryonala genomet och generera transgena djur främmande genetisk information efter överföring av de injicerade embryona för att främja mödrar. Efter framgångarna i möss, PN injektion har tillämpats framgångsrikt i många andra djurarter. Nyligen, PN injektion har lyckat använts att införa reagenser med gen-ändra aktiviteter, såsom CRISPR/Cas9 system att uppnå platsspecifika genetiska modifikationer i flera laboratorium samt djurarter. Förutom att behärska den speciella uppsättningen Mikroskop färdigheter att producera genetiskt modifierade djur genom PN injektion, måste forskare förstå de reproduktion fysiologi och beteende målarter, eftersom varje art presenterar unika utmaningar. Exempelvis gyllene syriska hamster embryon har unik hantering krav för in vitro- sådan att PN injektionstekniker inte var möjliga i denna art tills senaste genombrott av vår grupp. Med våra arter-modifierade PN injektion protokoll, har vi lyckats producera flera gen knockout (KO) och knockin (KI) hamstrar, som har använts framgångsrikt till modell mänskliga sjukdomar. Beskriver här vi PN injektionsproceduren för att leverera den CRISPR/Cas9 komplexa till zygoter hamster, embryo hantering villkor, embryo transfer förfaranden och djurhållning som krävs för att producera genetiskt modifierade hamstrar.

Protokollet beskrivs i producerar genetiskt modifierade hamstrar effektivitet beror på resultaten från följande två viktiga steg: live födelsetalen av mottagarens honor och antalet levande valpar med de avsedda genetiska modifieringar. Live nativiteten är ett direkt resultat av embryo kvalitet och skicklighet av individen utför PN injektionsstället och embryo transfer förfaranden. För att säkerställa att den utvecklande potentialen hos manipulerade embryon inte äventyras, är...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex at JoVE.com

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Pronukleär (PN) injektion av den klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) och CRISPR-associerade protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system är en mycket effektiv metod för att producera genetiskt modifierade gyllene syriska hamstrar. Häri, beskriver vi detaljerad PN injektion protokollet för produktion av genen knockout hamstrar med CRISPR/Cas9-systemet.

Produktion av genmanipulerade gyllene syriska hamstrar genom pronukleär injektion av CRISPR/Cas9 komplexet

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injicerbar and Drug belastad Supra Hydrogel för lokal kateter Injektion i Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering och potentiella användningsområdena för en 3D vävnadstekniska Human Esophageal Mucosal Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Realtidsövervakning av intracellulär Bile Acid Dynamics hjälp av en genetiskt kodad FRET-baserade Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produktion av metall nanopartiklar genom pulserad laserablation i vätskor: Ett verktyg för att studera de antibakteriella egenskaperna hos nanopartiklar

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produktion av kemikalier av<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Användning av bambuhydrolysat som råvara

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv produktion och redigering av Feeder-fri IPSCs från mänsklig bukspottkörtelns celler med hjälp av CRISPR-Cas9-systemet

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Golden' fluorescens vid selektionstryck inkorporering av icke-kanoniska aminosyror och proteinanalys av masspektrometri och fluorescens

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Mikroskop västra havren Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryon för könsceller omvandling eller CRISPR/Cas9 gen editering

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Snabb montering av multigenkonstruktioner med modulär Golden Gate-kloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...