Name: a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

الكتاب تود أن أشكر الأستاذ الدكتور ستيفان بيك والأستاذ الدكتور ماغدالينا غوتز مدخلاتها، والمساعدة والدعم في تطوير أسلوب كورالينا، ويسبيك ماكسيميليان وباومان فالنتين التعليقات المفيدة. العمل الذي أيده DFG (STR 1385/1-1).

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+profiles+to+function+in+epigenomics.">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORALINA:+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening.">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li><li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening.">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method.">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries.">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يمكن استخدام كورالينا إنشاء مكتبات جرنة واسعة النطاق بالهضم نوكلاس الخاضعة للهدف الحمض النووي والاستنساخ الناتجة عن الشظايا الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة بالجملة. الاستدلال الإحصائي يشير إلى أن العديد من أكثر من 107 جرنة الفردية تسلسل قد سبق تم بنجاح استنساخ استخدام البروتوكول في اليد9. يمكن تخصيص كورالينا بطرق متعددة. اختيار قالب الحمض النووي يحدد المنطقة المستهدفة وتعقيد القصوى من المكتبة التي تم إنشاؤها. باستخدام هذا البروتوكول، مكتبات كورالينا تم إنشاؤها مسبقاً من الإنسان والفأر الحمض النووي9. تصور الممثلة النتائج المعروضة هنا توليد مكتبة كورالينا من الحمض النووي BAC المنقي. يمكن إجراء مزيد من التخصيص باختيار تسلسل المتجهات ورابط التعبير جرنة. اختبرناها سابقا ثلاثة أزواج مختلفة الأطوال رابط للجمعية جيبسون مع اختلافات قليلة في كفاءة9.
بسبب أصلهم من جل هضم الحمض النووي، بروتوسباسير جرناس كورالينا لا تكون عادة بالضبط 20 شركة بريتيش بتروليوم في الطول، ولكن تبين توزيع طول بمتوسط يعتمد كلاهما على معلمات هضم منسى بالإضافة إلى حجم الختان مصنوعة من جل صفحة س. المثال الممثل هو مبين في الشكل 2 ج، يصور الشظايا بطول متوسط بين bp 19 و 27. في تجربتنا، طول الأجزاء يتم الاحتفاظ بإخلاص بروتوسباسير جرنة الذي تم إنشاؤه9. بينما الشظايا أقصر من 20 bp ينبغي تجنبها بسبب ارتفاع معدل خارج الهدف من جرناس الناتجة، وشظايا أطول على الأرجح أقل بكثير من مشكلة بالنسبة للتطبيقات المصب، حيث أنه كان أظهر أن جرناس مع بروتوسباسيرس ما دامت 45 بي بي لا تزال 9من الوظيفية.
الخطوات الأكثر أهمية اثنين في البروتوكول كورالينا هي اختيار حجم الشظايا يهضم منسى وخطوات الاستنساخ. جيل شظايا التي قصيرة جداً (مثلاً في المتوسط دون سن 18 عاماً bp) أو إدراج عدد كبير من ناقلات التعبير جرنة فارغة سوف تجعل المكتبة غير مجدية. وبالتالي، من المهم تحسين الخطوة الهضم مناسى (الشكل 2A)، لرصد الختان (الشكل 2، ج)، التحقق من الهضم الكامل للعمود الفقري ناقلات جرنا بما في ذلك أية عناصر تحكم جزء في جميع أنحاء البروتوكول. وقد الرعاية الخاصة أيضا التي يجب اتخاذها للمحافظة على تمثيل المكتبة جرنا. بشكل عام هو عنق الزجاجة مشتركة واحدة من مكتبة الجيل كفاءة نقل البلازميدات إلى البكتيريا للتضخيم. وهكذا، أن كميات كبيرة من البكتيريا مع الكفاءات الممتازة وعدد كبير من الأحداث انهانسر الفردية ضرورية لتحقيق عدد كبير من الحيوانات المستنسخة جرنة.
استراتيجيات جديدة لإنتاج مكتبة جرنة سيكون ضروريا لحصاد الإمكانات الكاملة للنهج المستندة إلى كريسبر الفرز العقود القادمة. وهناك طلب كبير على طرق فعالة من حيث التكلفة وبسيطة وقابلة للتخصيص لإنشاء مكتبات واسعة النطاق، شرطا مسبقاً لإجراء الفحص قابلة لعدد أكبر من نظم نموذجية والنهج الهندسية المختلفة على أساس كريسبر. يتم توفير كورالينا خطوة أولى نحو هذا. وتتعدد الاستخدامات المحتملة، لا سيما لإنتاج مكتبات شاملة للجينوم، وكدنا المستمدة مكتبات نظم نموذجية أقل شيوعاً والمكتبات شديدة التركيز والهياكل التجريبية التي البروتينات كريسبر مختلفة (مع اختلاف بام وتستخدم في الجمع بين متطلبات).
وخلافا لأساليب أخرى، يولد كورالينا جرناس ممكن جميع من مدخلات الحمض النووي. ومع ذلك، هو عيب واحد من الأسلوب أن جرناس تفتقر إلى التسلسل بام المطلوبة مدرجة أيضا في المكتبة، وهي ميزة أنها تشترك مع طريقة الانزيمية ثانية لجرنا مكتبة الجيل، أكل كريسبر (الجدول 1). اختيار الأسلوب المثالي جرنة مكتبة الجيل تعتمد على مواصفات فحص المخطط التجربة، لا سيما الطبيعة (الجينية، التنظيمية، إينتيرجينيك) وحجم المنطقة المستهدفة (محور واحد، ومناطق متعددة، على نطاق الجينوم). أننا نرى رأسا على عقب خاصة في استخدام كورالينا عند عدد كبير من غير الترميز أو المناطق التنظيمية ليتم تحليلها، إذا كانت هناك معلومات ناقصة أو غير موثوق بها تسلسل (نظم نموذجية الغريبة، وخليط من الأنواع (مثل ميكروبيوميس) أو حصل تجريبيا الإدخال)، إذا كان يتم الجمع بين مختلف كريسبر اندونوكليسيس أو إذا تشبع تحليل يقوم على محور قصيرة ومحددة (مثل يمثلها BACs).

بسبب تكييف النظام كريسبر/Cas9 البكتيرية كأداة استهداف جزيئي أحدث ثورة في البيولوجيا الجزيئية. ابدأ من قبل أنها لم تكن سهلة جداً للتلاعب الكروماتين في مواقع محددة بالجينوم. تشمل التطبيقات الشائعة كريسبر طفرات الجينات المستهدفة1، هندسة الجينوم2، ابيجينومي تحرير3والتنشيط النسخي والجينات إسكات4. إحدى مزايا خاصة للنظام كريسبر أن تطبيقاتها لا تقتصر على مواقع مرشحة مدروسة، مكتبات جرنة تشكل أقل من الشاشات منحازة. هذه تسهيل اكتشاف المكاني الوظيفية في الجينوم دون أي علم مسبق بالتجريبية. بيد حاليا معظمها يستند إلى بناء مكتبة جرنا توليف اليغو-النوكليوتيدات، وهناك خيارات محدودة لشراء مكتبات جرنا ليست للإنسان أو فتح مناطق المنشأ أو الهدف الماوس خارج قراءة الإطارات. وهكذا، على الرغم من أن شاشات كريسبر وبالفعل، أثبتت بشكل لا يصدق قوية5،6،،من78، كامل إمكاناتها لم لم تستغل.
مؤخرا وضعت للتغلب على الحد من جرنة الكلاسيكي توليد أساليب استراتيجيتين. على حد سواء تعتمد على الهضم الأنزيمي الخاضعة للرقابة للحمض النووي الهدف بدلاً من الاعتماد على توليف اليغنوكليوتيد مخصصة. بينما توظف كورالينا9 نوكلاس ميكروكوككال، الأسلوب البديل الوحيد المتاح حاليا، الأكل كريسبر10، يجعل استخدام إنزيمات التقييد (Hpaالثاني، سكرفالأول و منتدى بواو الآسيويالأول و مدامأنا). الأهم من ذلك، يمكن تطبيق التقنيات على حد سواء لأي إدخال الحمض النووي، والذي يخدم كمصدر لتسلسل بروتوسباسير جرنة. بينما تستخدم طريقة الأكل كريسبر استراتيجية لإنقاص عدد جرناس المستنسخة التي تستهدف مواقع لا يتبعها بام S.pyogenes المطلوبة (الدافع المتاخمة بروتوسباسير)، فإنه ينشئ سوى جزء صغير من جميع جرناس الفنية الممكنة منطقة بعينها. من ناحية أخرى، كورالينا، قادرة على توليد جميع جرناس المحتملة لتسلسل المصدر، ولكن يشمل أيضا نسبة أعلى من أدلة غير وظيفية. جرنا مكتبة جيل من خلال نشاط نوكلياسي التي تسيطر عليها تمكن من مكتبات جرنا شاملة لأي الأنواع، الإنتاج أي نظام Cas9-البروتين-أو المستجيب بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، كورالينا قابلة للتخصيص، والتكيف مع خيارات الإدخال وناقلات المناسبة تحديد مكتبة نوع وحجم ومحتوى. هنا، يرد بروتوكول تفصيلية التي يمكن استخدامها لتوليد مكتبات شاملة جرنة من مصادر متنوعة من الحمض النووي (الشكل 1)، بما في ذلك الصبغيات الاصطناعية البكتيرية (BACs) أو المجينية الحمض الخلوي الصبغي9. استخلصت النتائج التمثيلية المصاحبة لهذا البروتوكول بتطبيق البروتوكول كورالينا إلى BAC الحمض النووي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">500 mM EGTA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">03777-10G</td>
			<td style="width:272px;">1.4., Inactivation of Mnase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6678</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Gels, 20%, 10 well</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">EC6315BOX</td>
			<td style="width:272px;">2.1., pre-made 20 % PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">O&#39;RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">SM1303</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Running Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6675</td>
			<td style="width:272px;">2.1., PAGE gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Disposable scalpel, sterile</td>
			<td style="width:139px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:140px;">233-5363&#160;</td>
			<td style="width:272px;">2.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;"> 
			S9430</td>
			<td style="width:272px;">2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15593-031</td>
			<td style="width:272px;">3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycogen</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">10901393001</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">3M Sodium acetate , pH5.2</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">&#160; R1181</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:272px;">3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Quick blunting kit&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">E1201</td>
			<td style="width:272px;">4.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">ammomium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1542</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">magnesium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			M5661</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">&#160; MOLEM37465520 (or Promega V4231)</td>
			<td style="width:272px;">2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:139px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:140px;">A63881</td>
			<td style="width:272px;">5.3. + 6.5.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:139px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:140px;">28704</td>
			<td style="width:272px;">5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">concentrated T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">&#160;M0202T</td>
			<td style="width:272px;">6.1.+ 8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Long Amp Taq 2X Master Mix&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0287S</td>
			<td style="width:272px;">6.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0531S</td>
			<td style="width:272px;">5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">HindIII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0104S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">SacII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0157S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">AgeI</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0552S</td>
			<td style="width:272px;">8.2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Tris base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">2M MgCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">N0446S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">DTT</td>
			<td style="width:139px;">Sigam</td>
			<td style="width:140px;"> 
			DTT-RO</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">PEG-8000&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			P5413</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">NAD</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			N6522</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0363S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Phusion DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0530S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0208L</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">rSAP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0371S</td>
			<td style="width:272px;">8.3.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">TG1 competent cells</td>
			<td style="width:139px;">Lucigen</td>
			<td style="width:140px;">60502-1</td>
			<td style="width:272px;">9.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">1mm gap electroporation cuvettes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">732-2267&#160;</td>
			<td style="width:272px;">10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">DIS-988-010M&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S7653&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Bacto-tryptone</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">211705</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">212750</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Agar</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1296</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			G5516</td>
			<td style="width:272px;">9.17.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">MNAse</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>throughout</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micropulser</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>732-2267&#160;</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>9.1-9.9.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source

شعبية للنظام كريسبر/Cas9 للجينوم والهندسة ابيجينومي ينبع من بساطته والقدرة على التكيف. ويستهدف المستجيب (نوكلاس Cas9 أو بروتين انصهار dCas9 نوكلاس-الميت) إلى موقع معين في الجينوم الجيش النيبالي الملكي صغيرة اصطناعية المعروفة بدليل الحمض النووي الريبي، أو جرنة. طبيعة النظام كريسبر ثنائي يمكن استخدامه في فرز النهج منذ بلازميد مكتبات الأشرطة التعبير التي تحتوي على الآلاف من جرناس الفردية يمكن استخدامها لاستجواب العديد من المواقع المختلفة في تجربة واحدة.
وحتى الآن، تم إنشاؤها تسلسل جرنة لتشييد المكتبات حصرا تقريبا بتوليف اليغنوكليوتيد، مما يحد من تعقيد يمكن تحقيقها من تسلسل في المكتبة وهي باهظة التكلفة نسبيا. هنا، البروتوكول مفصلاً كورالينا (جرنة شامل مكتبة الجيل من خلال نشاط نوكلاس الخاضعة للرقابة)، بسيطة وطريقة فعالة من حيث التكلفة لتوليد المكتبات جرنة معقدة للغاية تستند الهضم الأنزيمي لإدخال الحمض النووي، وهو وصف. حيث يمكن إنشاء مكتبات كورالينا من أي مصدر للحمض النووي، الكثير من الخيارات للتخصيص موجودة، تمكين مجموعة كبيرة ومتنوعة من الشاشات المستندة إلى كريسبر.

استخدام البروتوكول في متناول اليد، تم إنشاؤها كورالينا جرنة المكتبات من الإنسان والفأر المجينية الحمض الخلوي الصبغي9 و "باك الحمض النووي" (الشكل 1). لإنتاج أجزاء من الحمض النووي الإدخال المناسبة للاستنساخ في ناقلات التعبير جرنة، يجب أن تحدد الظروف المثلى الهضم نوكلاس الخاضعة للرقابة. نتيجة نموذجية للاستفادة المثلى الهضم نوكلياسي ميكروكوككال هو مبين في الشكل 2 ألف. كمية غير كافية من نوكلياسي (0، 1، 2، 3، 4، 4.5 أو 5 وحدات) تنتج 5.5-7.5 وحدات ولا منتجات ملحوظ في نطاق الحجم المطلوب (10-100 شركة بريتيش بتروليوم) لا تزال تنتج الشظايا التي في المتوسط طويل جداً. كميات أكبر من إنزيم (50 وحدة) يؤدي إلى تدهور المفرط لإدخال الحمض النووي بعد 10 دقائق. ونتيجة لذلك، تم اختيار مبلغ متوسطة (10 وحدات). وكان تصعيد الخلاصة لإنتاج ما يكفي يهضم الشظايا لتنقية اللاحقة والاستنساخ (الشكل 2). في حين يفضل أعمى حدد شظايا من الحمض النووي حسب الحجم وتعتمد فقط على سلم الحمض النووي للتوجه للحد من التعرض لشظايا من الحمض النووي للأشعة فوق البنفسجية، يمكن الملون الجل بعد ذلك لمراقبة جودة الهضم وقطع. يظهر الشكل 2B مثال ممثل من جل صفحة من الحمض النووي الذي يكون قد اقتطعت شظايا بين 20 و 30 شركة بريتيش بتروليوم. هلام تنقية منسى الشظايا التي تم تحميلها على 20 ٪ هلام الصفحة للتحقق من تحديد حجم النجاح وتنقية من شظايا يهضم منسى (الشكل 2). البروتوكول في متناول اليد متوافق مع استخدام تسلسلات رابط مخصص، السماح لاستنساخ الأجزاء يهضم منسى في ناقلات التعبير جرنة الاختيار. هنا، جرنة-بلكو9 كالعمود الفقري. Linkers تتضخم من ناقلات التعبير جرنا باستخدام PCR القياسية. ويصور الشكل 2D مثال ممثل لتسلسل رابط تضخيم خالية إضافية، غير صحيحة أو لا قالب أمبليكونس. وبعد ذلك، يتم هضمها أمبليكونس رابط مع إنزيمات التقييد لضمان linkers هي متصلة على شظايا يهضم منسى في الاتجاه الصحيح. الشكل 2D يظهر الجل [اغروس] من linkers 5 'و 3' قبل وبعد الهضم مع هندالثالث و الكيسالثاني على التوالي، مما يشير إلى الهضم الكامل ل linkers إلى 637 المتوقعة و 295 bp. الجزء الأيسر من الصورة جل الوثائق ختان البنات أجزاء رابط هضمها. يلي جل استخراج linkers هضمها، تتمثل الخطوة التالية في البروتوكول الربط linkers إلى شظايا يهضم منسى إصلاحه نهاية. لأنه يتم إنشاء رابط تسلسل من [بكر] كبسولة تفجير أونفوسفوريلاتيد باستخدام، يجب أن لا تحدث عملية ربط الذاتي من linkers. إلا إصلاح نهاية يهضم منسى الشظايا من الحمض النووي توفر مجموعات الفوسفات اللازمة لربط. عقب الترجمة نك، يتم تضخيمه ربط المنتج ببكر. من أجل تجنب التحيز التضخيم PCR المفرطة التي يمكن أن تحرف تمثيل تسلسل جرنة في المكتبة، والتضخيم يقتصر على دورات أقل من 20 في المجموع. عقب بكر، يصعب تصور في الهلام [اغروس] منتجات التضخيم. ولذلك تتم للكشف عن المنتجات تقارير إتمام المشروعات تحكم منفصلة مع دورات 32 (ولكن لا يتم استخدامها لإعداد مكتبة). وتظهر نتائج من عنصر التحكم هذا بكر في الشكل 2E. وهذا ما يسمح لتحسين ردود الفعل ربط ولضمان ردود الفعل تخلو PCR المصنوعات اليدوية، والتي تحدث أحياناً في "عناصر تحكم لا شظايا" (NFC). يظهر الشكل 2E amplicon المطلوب (بلغة الحمض النووي + 5 'رابط + 3' رابط، الطول: 869 bp) بعد التضخيم من ردود الفعل ربط باستخدام اكويمولار (1:1) النسب بين الأجزاء وتسلسل رابط.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> الشكل 1 : اقتراح جدول زمني لإعداد مكتبة جرنة- ويقدم كورالينا استراتيجية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد مكتبات شاملة جرنة من مجموعة كبيرة مصادر مختلفة من الحمض النووي من أي كائن حي. يمكن أن تتحقق في البروتوكول في متناول اليد للإنجاز خلال أسبوع عمل واحد. يمكن أن يؤديها توليد رابط بالتوازي مع نهاية-إصلاح الحمض النووي. إعداد البكتيريا اليكتروكومبيتينت يستغرق يومين وتتضمن خطوة نمو بين عشية وضحاها ولذلك ينبغي أن تبدأ قبل الجمعية يتم إعداد ردود الفعل. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> الشكل 2 : خطوات حاسمة خلال البروتوكول. تمكن الهضم الخاضعة للرقابة (A) من "الحمض النووي باك" جيل شظايا من أحجام مختلفة. يظهر هنا هو الأمثل الهضم منسى. وعولج المنقي BAC الحمض النووي مع كميات مختلفة من منسى لتوليد 10 دقيقة 10 يو من منسى شظايا من الحمض النووي للطول المطلوب (20-30 بي بي). (ب) حجم التحديد الأجزاء بين 20 و 30 شركة بريتيش بتروليوم استخدام الختان من الجل بولياكريلاميدي. تنقية الحمض النووي BAC عومل مع 10 يو من منسى لمدة 10 دقائق. وقد سجلت الصورة بعد الختان. (ج) مراقبة جودة أجزاء تنقية هلام. بعد تنقية هلام، 1/6 من مناسى المنقي كان حملت الشظايا على 20 ٪ هلام الصفحة للتحقق من تحديد حجم النجاح وتنقية. (د) التضخيم من تسلسلات رابط للجمعية وتقييد إنزيم هضم linkers لكفالة استنساخ اتجاهي. تم تضخيم linkers 5 'و 3' وقطع مع هنديي و ساسي، على التوالي. قالب لا يتحكم (المجلس الوطني الانتقالي) أدرجت لعنصر التحكم للمصنوعات اليدوية بكر وتلويث الحمض النووي. اليسار: تطبيق نموذج تحليلي؛ الصحيح: تطبيق نموذج محضرة. وسجلت الصورة بعد الختان هلام. (ﻫ) ربط ناجحة من linkers إلى شظايا من الحمض النووي يمكن تحليلها باستخدام PCR مع زيادة عدد دورات بكر (32)، ويسيطر عليها أداء لا عناصر القالب مع ح2س (المجلس الوطني الانتقالي) أو استخدام المجلس الوطني الانتقالي من الخطوة السابقة الترجمة نك كإدخال (المجلس الوطني الانتقالي NT)). من المهم أن تشمل لا جزء (NFC)، وهو تحكم تضخيم من ربط ورد فعل الترجمة نك من التي تم حذف أجزاء مناسى. فقط إنتاج عينات في مناسى التي جمعت شظايا مع رابط الحمض النووي amplicon المتوقعة (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

ينبغي أن تكون أساليب لإنشاء مكتبات واسعة النطاق جرنة بسيطة وتتسم بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة. يصف لنا وضع بروتوكول لإنتاج مكتبات جرنة استناداً إلى الهضم الأنزيمي للهدف الحمض النووي. هذا الأسلوب، يعرض كورالينا (جرنة شامل مكتبة الجيل من خلال نشاط نوكلاس الخاضعة للرقابة) كبديل لتوليف اليغنوكليوتيد مخصصة مكلفة.

بروتوكول عالمي جرنة على نطاق واسع "الإنتاج مكتبة" من أي "مصدر الحمض النووي"

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

تسلسل ميكرورنا أثر رجعي: الحمض النووي التكميلية المكتبة إعداد بروتوكول باستخدام عينات الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الحمض النووي الريبي

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

معالجات الجينوم الإدخال تسلسل إعداد مكتبة من عينة تارديجرادي واحد

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

بروتوكول قابل للتخصيص "الجمعية سلسلة" جرنة الاستنساخ (ستأجر)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

الجينات المباشرة ضرب من Axolotl الحبل الشوكي الخلايا الجذعية العصبية عن طريق الكهربائي من المجمعات CAS9 البروتين-gRNA

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

خط أنابيب كامل لعزل وتسلسل MicroRNAs، وتحليلها باستخدام أدوات المصادر المفتوحة

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...