Name: a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Prof. Dr. Stephan Beck og Prof. Dr. Magdalena Goetz for deres input, hjælp og støtte i udviklingen af CORALINA metoden, Maximilian Wiessbeck og Valentin Baumann til nyttige kommentarer. Arbejdet er blevet støttet af DFG (STR 1385/1-1).

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+profiles+to+function+in+epigenomics.">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORALINA:+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening.">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li><li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening.">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method.">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries.">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

CORALINA kan bruges til at generere store skala gRNA biblioteker af kontrollerede nukleasen fordøjelsen af target-DNA og bulk kloning af resulterende dobbelt strandede fragmenter. Statistisk inferens indikerer, at mange flere end 107 individuelle gRNA sekvenser har allerede blevet med held klonede ved hjælp af protokollen på side9. CORALINA kan tilpasses på flere måder. Valget af DNA-template definerer målområde og maksimal kompleksiteten af den genererede bibliotek. Ved hjælp af denne protokol, CORALINA biblioteker tidligere er blevet genereret fra mennesker og mus genomisk DNA9. Repræsentative resultater præsenteret her skildre generation af en CORALINA bibliotek fra renset BAC DNA. Yderligere tilpasning kan opnås ved valg af gRNA udtryk vektor og linker sekvenser. Vi har tidligere prøvet tre forskellige par linker længder til Gibson forsamling med små variationer i effektivitet9.
På grund af deres oprindelse fra bulk fordøjet DNA, er protospacer i CORALINA gRNAs normalt ikke præcis 20 bp i længden, men Vis en længde distribution med et middel, der afhænger både parametrene for MNase fordøjelsen samt størrelsen af excision fremstillet af side gel s. den repræsentative eksempel vist i figur 2B og C, skildrer fragmenter med en median længde mellem 19 og 27 bp. Vores erfaring, er længden af fragmenter trofast bevaret af genererede gRNA protospacer9. Mens fragmenter kortere end 20 bp bør undgås på grund af højere ud målbeløbet af resulterende gRNAs, længere fragmenter er sandsynligvis langt mindre af et problem for downstream applikationer, da det er blevet påvist, at gRNAs med protospacers så længe 45 bp er stadig funktionelle9.
De to mest kritiske trin i CORALINA protokol er størrelse udvælgelse af MNase-fordøjet fragmenter og kloning trin. Generation af fragmenter, der er for kort (f.eks. gennemsnit under 18 bp) eller indarbejdelse af for mange tomme gRNA udtryk vektorer vil gøre biblioteket ubrugelig. Det er således vigtigt at optimere MNase fordøjelse trin (figur 2A), til at overvåge excision (figur 2B, C), check for komplet foraskning af gRNA vektor rygraden og herunder ingen fragment kontrol i hele protokollen. Særlig omhu har også at bevare repræsentation af gRNA bibliotek. Én fælles flaskehals i biblioteket generation er generelt effektiv overførsel af plasmider til bakterier til forstærkning. Således er store mængder af bakterier med fremragende kompetence og et stort antal individuelle elektroporation begivenheder nødvendige for at opnå et højt antal gRNA kloner.
Nye strategier for gRNA bibliotek produktion vil være nødvendigt at høste det fulde potentiale af CRISPR-baseret screening tilgang i de næste årtier. Der er en betydelig efterspørgsel efter omkostningseffektive, simple og tilpasselig metoder til at generere store biblioteker, en forudsætning at gøre screening imødekommenhed over for et større antal modelsystemer og forskellige CRISPR-baserede engineering tilgange. CORALINA giver et første skridt mod dette. De potentielle anvendelser er mangfoldige, især til at producere omfattende biblioteker af genomer, cDNA afledt biblioteker af mindre almindelige modelsystemer, stærkt koncentreret biblioteker og eksperimenterende set-ups i hvilke forskellige CRISPR proteiner (med forskellige PAM krav) anvendes i kombination.
I modsætning til andre metoder genererer CORALINA alle mulige gRNAs fra input DNA. En ulempe ved metoden er imidlertid at gRNAs mangler de krævede PAM sekvens indgår også i biblioteket, en funktion, som den deler med en anden enzymatisk metode for gRNA bibliotek generation, CRISPR-spiser (tabel 1). Valg af den ideelle metode for gRNA bibliotek generation afhænger specifikationerne af den planlagte screening eksperimentere, især arten (genic, lovgivningsmæssige, intergenic) og størrelse af målområde (enkelt locus, flere regioner, genome-wide). Vi ser en særlig opadrettede i hjælp CORALINA når et stort antal ikke-kodende eller lovgivningsmæssige områder er der skal analyseres, hvis der er ufuldstændige eller upålidelige sekvens oplysninger (eksotiske modelsystemer, blandinger af arter (f.eks. microbiomes) eller eksperimentelt indhentet input), hvis forskellige CRISPR endonucleases er kombineret eller hvis mætte analyse er udført på en kort og afgrænset locus (f.eks. repræsenteret ved BACs).

Tilpasning af bakterielle CRISPR/Cas9-systemet som en Molekylær målretning værktøj forårsagede den seneste revolution i Molekylærbiologi. Aldrig før har det været så nemt at manipulere kromatin definerede genomisk steder. Fælles anvendelser af CRISPR omfatter målrettede gen mutationer1, genom engineering2, epigenome redigering3, transcriptional aktivering og genhæmning4. En særlig fordel ved CRISPR systemet er, at dens anvendelser ikke er begrænset til velundersøgte kandidat websteder, som gRNA biblioteker gøre mindre forudindtaget skærme muligt. Disse lette opdagelsen af funktionelle loci i genom uden nogen forudgående eksperimentelle viden. Dog gRNA bibliotek byggeri er i øjeblikket for det meste baseret på oligo-nukleotid syntesen, og der er begrænsede muligheder for at købe gRNA biblioteker, som ikke er af menneskelige eller mus oprindelse eller target regioner uden for åbne læsning rammer. Således, selv om CRISPR skærme har allerede vist sig utrolig potent5,6,7,8, deres fulde potentiale endnu ikke blevet udnyttet.
For at overvinde begrænsning af klassisk gRNA generation metoder to strategier er for nylig blevet udviklet. Begge er baseret på kontrollerede Enzymatisk nedbrydning af target DNA i stedet stole på brugerdefinerede oligonukleotid syntese. Mens CORALINA9 beskæftiger micrococcal nukleasen, metoden kun aktuelt tilgængelige alternative CRISPR-SPISE10, gør brug af restriktionsenzymer (HpaII, ScrFjeg, Bfajeg og Mmejeg). Vigtigere, kan begge teknikker anvendes på ethvert input DNA, som fungerer som kilde til gRNA protospacer sekvenser. Mens metoden CRISPR-spiser beskæftiger en strategi til at mindske antallet af klonede gRNAs hvis målretning websteder ikke er efterfulgt af den krævede S.pyogenes PAM (protospacer tilstødende motiv), det skaber kun en lille brøkdel af alle mulige funktionelle gRNAs for en given region. CORALINA, på den anden side er i stand til at generere alle mulige gRNAs for kilde sekvens, men indeholder også en højere brøkdel af ikke-funktionelle guider. gRNA bibliotek generation gennem kontrolleret nukleasen aktivitet giver mulighed for fremstilling af omfattende gRNA biblioteker for alle arter, eventuelle Cas9-protein eller -effektor system i en enkel og omkostningseffektiv måde. CORALINA er desuden tilpasses for tilpasning, som passende input og vektor valg definerer den type dokumentbibliotek, størrelse og indhold. En detaljeret protokol præsenteres her, kan bruges til den generation af omfattende gRNA biblioteker fra forskellige kilder af DNA (figur 1), herunder bakteriel kunstige kromosomer (BACs) eller genomisk DNA9. De repræsentative resultater ledsager denne protokol blev afledt ved at anvende CORALINA protokol til BAC DNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">500 mM EGTA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">03777-10G</td>
			<td style="width:272px;">1.4., Inactivation of Mnase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6678</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Gels, 20%, 10 well</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">EC6315BOX</td>
			<td style="width:272px;">2.1., pre-made 20 % PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">O&#39;RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">SM1303</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Running Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6675</td>
			<td style="width:272px;">2.1., PAGE gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Disposable scalpel, sterile</td>
			<td style="width:139px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:140px;">233-5363&#160;</td>
			<td style="width:272px;">2.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;"> 
			S9430</td>
			<td style="width:272px;">2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15593-031</td>
			<td style="width:272px;">3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycogen</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">10901393001</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">3M Sodium acetate , pH5.2</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">&#160; R1181</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:272px;">3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Quick blunting kit&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">E1201</td>
			<td style="width:272px;">4.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">ammomium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1542</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">magnesium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			M5661</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">&#160; MOLEM37465520 (or Promega V4231)</td>
			<td style="width:272px;">2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:139px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:140px;">A63881</td>
			<td style="width:272px;">5.3. + 6.5.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:139px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:140px;">28704</td>
			<td style="width:272px;">5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">concentrated T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">&#160;M0202T</td>
			<td style="width:272px;">6.1.+ 8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Long Amp Taq 2X Master Mix&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0287S</td>
			<td style="width:272px;">6.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0531S</td>
			<td style="width:272px;">5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">HindIII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0104S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">SacII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0157S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">AgeI</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0552S</td>
			<td style="width:272px;">8.2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Tris base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">2M MgCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">N0446S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">DTT</td>
			<td style="width:139px;">Sigam</td>
			<td style="width:140px;"> 
			DTT-RO</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">PEG-8000&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			P5413</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">NAD</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			N6522</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0363S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Phusion DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0530S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0208L</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">rSAP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0371S</td>
			<td style="width:272px;">8.3.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">TG1 competent cells</td>
			<td style="width:139px;">Lucigen</td>
			<td style="width:140px;">60502-1</td>
			<td style="width:272px;">9.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">1mm gap electroporation cuvettes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">732-2267&#160;</td>
			<td style="width:272px;">10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">DIS-988-010M&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S7653&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Bacto-tryptone</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">211705</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">212750</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Agar</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1296</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			G5516</td>
			<td style="width:272px;">9.17.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">MNAse</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>throughout</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micropulser</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>732-2267&#160;</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>9.1-9.9.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source

Populariteten af CRISPR/Cas9-system for både genom og epigenome engineering skyldes dets enkelthed og tilpasningsevne. En effektor (Cas9 nukleasen eller en nukleasen-døde dCas9 fusion protein) er målrettet mod et bestemt websted i genomet ved en lille syntetisk RNA kendt som guide RNA eller gRNA. Den todelte karakter af CRISPR systemet muliggør dets brug i screening tilgange siden plasmid biblioteker indeholder udtryk kassetter af tusindvis af individuelle gRNAs kan bruges til at afhøre mange forskellige websteder i et enkelt eksperiment.
Til dato, har gRNA sekvenser for opførelsen af biblioteker været næsten udelukkende genereret af oligonukleotid syntese, som begrænser den opnåelige kompleksiteten af sekvenser i biblioteket og er relativt omkostningskrævende. Her, en detaljeret protokol for CORALINA (omfattende gRNA bibliotek generation gennem kontrolleret nukleasen aktivitet), en enkel og omkostningseffektiv metode til generation af meget komplekse gRNA biblioteker baseret på Enzymatisk nedbrydning af input DNA, er beskrevet. Da CORALINA biblioteker kan oprettes fra enhver kilde til DNA, findes masser af muligheder for tilpasning, gør det muligt for en lang række CRISPR-baserede skærme.

Ved hjælp af protokollen ved hånden, er CORALINA gRNA biblioteker blevet genereret fra mennesker og mus genomisk DNA9 og BAC DNA (figur 1). For at producere fragmenter af input DNA egnet til kloning i gRNA udtryk vektorer, har optimale betingelser for kontrolleret nukleasen fordøjelsen skal fastlægges. En typisk resultat for optimering af micrococcal nukleasen fordøjelsen er afbildet i figur 2A. Utilstrækkelig mængde af nukleasen (0,1, 2, 3, 4, 4.5 eller 5 enheder) producerer ingen mærkbar produkter i den krævede størrelsesområde (10-100 bp) og 5.5-7,5 enheder stadig produceres fragmenter, der er i gennemsnit for længe. Større mængder af enzymet (50 enheder) fører til overdreven nedbrydning af input DNA efter 10 min. En mellemliggende beløb blev derfor valgt (10 enheder). Digest'en blev skaleret til at producere nok fordøjet fragmenter for efterfølgende rensning og kloning (figur 2B). Mens det anbefales at blindt vælge DNA fragmenter efter størrelse og kun stole på DNA stigen til orientering at minimere eksponering af DNA-fragmenter for UV-lys, kan geler farves bagefter for kvalitetskontrol af fordøjelsen og skæring. Figur 2B viser et repræsentativt eksempel på en side gel fra hvilke DNA fragmenter mellem 20 og 30 bp har været skåret ud. Gel renset MNase fragmenter blev læsset på en 20% siden gel for at kontrollere succes størrelse udvælgelse og rensning af MNase-fordøjet fragmenter (fig. 2 c). Protokol ved hånden er kompatibel med brug af tilpassede linker sekvenser, gør det muligt for at klone de MNase-fordøjet fragmenter i gRNA udtryk vektorer af valg. Her, blev gRNA-PLKO9 brugt som rygrad. Linkers forstærkes fra gRNA udtryk vektor ved hjælp af standard PCR. Figur 2D skildrer et repræsentativt eksempel på forstærkede linker sekvenser blottet for yderligere, forkert eller ingen skabelon amplikoner. Næste, linker amplikoner fordøjes med restriktionsenzymer at sikre linkers er forbundet til MNase-fordøjet fragmenter i den rigtige retning. Figur 2D viser agarosegelitris af 5' og 3' linkers før og efter fordøjelse med HindIII og SacII henholdsvis, der angiver komplet foraskning af linkers til de forudsagte 637 og 295 bp. Den højre del af billedet, gel dokumenter excision af fordøjet linker fragmenter. Følgende gel udvinding af fordøjet linkers, det næste skridt i protokollen er ligatur af linkers til slutningen-reparerede MNase-fordøjet fragmenter. Fordi linker sekvenser er genereret af PCR med unphosphorylated primere, bør selvstændig ligatur af linkers ikke forekomme. Kun de ende-reparerede MNase-fordøjet DNA fragmenter giver grupperne fosfat nødvendige for ligatur. Efter nick oversættelse, ligatur produkt der forstærkes ved PCR. For at undgå overdreven PCR forstærkning bias, som kan give en skævhed repræsentation af gRNA sekvenser i biblioteket, er forstærkning begrænset til mindre end 20 cyklusser i alt. Efter PCR er forstærkning produkter svært at visualisere på agarosegelitris. Separat kontrol PCR'er med 32 cyklusser er derfor udføres for at påvise produkterne (men anvendes ikke til biblioteket forberedelse). Resultaterne fra denne kontrol PCR er vist i figur 2E. Dette giver mulighed for at optimere ligatur reaktioner og sikre reaktioner er blottet for PCR artefakter, der undertiden opstår i "ingen fragmenter kontrol" (NFC). Figur 2E viser den ønskede amplikon (5' linker + DNA fragment + 3' linker, længde: 869 bp) efter forstærkning af ligatur reaktioner ved hjælp af equimolar (1:1) forholdet mellem fragmenter og linker sekvenser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Figur 1 : Foreslog tidslinjen for at forberede en gRNA bibliotek. CORALINA tilbyder en enkel og omkostningseffektiv strategi for generation af omfattende gRNA biblioteker fra et væld af forskellige DNA kilder fra enhver organisme. Protokol ved hånden kan bringes til afslutning under én arbejdsuge. Linker generation kan udføres parallelt med DNA ende-reparation. Forberedelse af electrocompetent bakterier tager to dage og omfatter en overnight vækst trin og skal derfor startes før montering reaktioner er oprettet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Figur 2 : Kritisk trin under protokollen. (A) kontrollerede fordøjelsen af BAC DNA giver generation af fragmenter af forskellige størrelser. Vist her er optimering af MNase fordøjelse. Renset BAC DNA blev behandlet med forskellige mængder af MNase for 10 min. 10 U af MNase generere DNA fragmenter af den ønskede længde (20-30 bp). (B) størrelse udvalg af fragmenter mellem 20 og 30 bp bruger excision fra polyacrylamidgeler. Renset BAC DNA blev behandlet med 10 U i MNase i 10 min. Billedet blev optaget efter excision. (C) kvalitetskontrol af gel-renset fragmenter. Efter gel-rensning, 1/6th af den renset MNase fragmenter blev læsset på en 20% siden gel til at kontrollere succes størrelse udvælgelse og rensning. (D) forstærkning af linker sekvenser for forsamlingen og begrænsning enzym fordøjelsen af linkers at sikre retningsbestemt kloning. 5' og 3' linkers blev forstærket og skære med HindIII og SacII, henholdsvis. No-skabelon kontrolelementer (NTC) blev inkluderet til kontrol for PCR artefakter og DNA forurening. Venstre: analytiske eksempelprogrammet; højre: forberedende eksempelprogrammet. Billedet blev optaget efter gel excision. (E) vellykket ligatur af linkers til DNA-fragmenter kan analyseres ved hjælp af PCR med et øget antal PCR cyklusser (32) og kontrolleret af foretager ingen skabelon kontrol med H2O (NTC) eller ved hjælp af NTC fra det forrige nick oversættelsestrin som input (NTC NT)). Det er vigtigt at medtage en ingen fragment kontrol (NFC), hvilket er en forstærkning fra en ligatur og nick oversættelse reaktion fra som MNase fragmenter blev udeladt. Kun prøver i hvilke MNase fragmenter er blevet kombineret med linker DNA producere det forventede amplikon (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Metoder til at generere store gRNA biblioteker skal være enkel, effektiv og omkostningseffektiv. Vi beskriver en protokol til produktion af gRNA biblioteker baseret på Enzymatisk nedbrydning af target-DNA. Denne metode, CORALINA (omfattende gRNA bibliotek generation gennem kontrolleret nukleasen aktivitet) præsenterer et alternativ til dyre brugerdefinerede oligonukleotid syntese.

En universel protokol for storstilet gRNA bibliotek produktion fra enhver kilde, DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isoleret og høj overførselshastighed sekventering bibliotek konstruktion til Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input Genome Sequencing bibliotek forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøvemateriale

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserede overekspression bibliotek Screening i gær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

En tilpasselig protokol for streng forsamling gRNA kloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering af en universel indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion til påvisning af Lyssavira

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Direkte gen knock-out af Axolotl rygmarv neurale stamceller via elektroporation af CAS9 protein-gRNA komplekser

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

En komplet pipeline til isolering og sekvensering af MicroRNAs og analyse af dem ved hjælp af open source-værktøjer

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...