Name: a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

De auteurs zou willen van Prof. Dr. Stephan Beck en Prof. Dr. Magdalena Goetz bedanken voor hun inbreng, te helpen en te ondersteunen bij de ontwikkeling van de CORALINA-methode, Maximilian Wiessbeck en Valentin Baumann voor nuttige opmerkingen. Het werk werd ondersteund door DFG (STR 1385/1-1).

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+profiles+to+function+in+epigenomics.">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORALINA:+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening.">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li><li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening.">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method.">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries.">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

CORALINA kan worden gebruikt voor het genereren van grootschalige gRNA bibliotheken door gecontroleerde nuclease spijsvertering van DNA van het doel en bulk klonen van resulterende dubbele gestrande fragmenten. Statistische inferentie geeft aan dat veel meer dan 107 individuele gRNA sequenties hebben al met succes gekloond met behulp van het protocol op9van de hand. CORALINA kan op meerdere manieren worden aangepast. De keuze van de sjabloon DNA definieert de doel-regio en de maximale complexiteit van de gegenereerde bibliotheek. Met behulp van dit protocol, CORALINA bibliotheken zijn eerder gegenereerd van mens en muis genomic DNA9. Representatieve resultaten die hier gepresenteerd verbeelden de generatie van de bibliotheek van een CORALINA uit gezuiverde BAC DNA. Verdere aanpassingen kan worden bereikt door de keuze van vector- en linker opeenvolgingen van gRNA expressie. Wij hebben drie verschillende paren van linker lengtes voor Gibson montage met kleine variaties in efficiëntie9eerder beproefd.
Als gevolg van hun oorsprong uit bulk verteerd DNA, protospacer van CORALINA gRNAs zijn meestal niet precies 20 bp in lengte, maar de show een lengte-verdeling met een gemiddelde dat beide hangt af van de parameters van de MNase spijsvertering en de grootte van de besnijdenis gemaakt van de pagina gel s. de representatief voorbeeld weergegeven in figuur 2B en C, toont fragmenten met een gemiddelde lengte tussen 19 en 27 bp. In onze ervaring, is de lengte van de fragmenten getrouw bewaard door de gegenereerde gRNA protospacer9. Terwijl fragmenten korter dan 20 bp dient vermeden te worden als gevolg van hogere af-streefpercentage van resulterende gRNAs, langere fragmenten zijn waarschijnlijk veel minder een probleem voor downstream toepassingen, sinds het aangetoond dat gRNAs met protospacers, zolang 45 bp zijn nog steeds functionele9.
De twee belangrijkste stappen in het CORALINA-protocol zijn de selectie van de grootte van fragmenten MNase-verteerd en klonen stappen. Generatie van fragmenten die te kort zijn (bijvoorbeeld de gemiddelde onder 18 bp) of opneming van teveel lege gRNA expressievectoren zal de bibliotheek maken nutteloos. Het is dus belangrijk om te optimaliseren de MNase spijsvertering stap (figuur 2A), volgen van excisie (figuur 2B, C), controleren voor volledige spijsvertering van de ruggengraat van de vector gRNA en inclusief geen fragment besturingselementen in het gehele protocol. Speciale zorg moet ook worden gehouden voor het behoud van de vertegenwoordiging van de gRNA-bibliotheek. Één gemeenschappelijke knelpunt van bibliotheek generatie is in het algemeen de efficiënte omzetting van plasmiden in bacteriën voor versterking. Dus zijn grote hoeveelheden bacteriën met uitstekende bekwaamheid en een groot aantal individuele electroporation gebeurtenissen noodzakelijk voor het bereiken van een groot aantal gRNA klonen.
Nieuwe strategieën voor de productie van de bibliotheek van de gRNA zal men moeten oogsten van het volledige potentieel van screening CRISPR gebaseerde benaderingen in de komende decennia. Er is een significante vraag naar aanpasbare, kosteneffectieve en eenvoudige methoden voor het genereren van grote bibliotheken, een eerste vereiste om screening vatbaar voor een groter aantal modelsystemen en verschillende CRISPR gebaseerde engineering benaderingen. CORALINA is het verstrekken van een eerste stap naar dit. De mogelijke toepassingen zijn divers, met name voor de productie van uitgebreide bibliotheken van genomen, cDNA bibliotheken van minder voorkomende modelsystemen, zeer gerichte bibliotheken en experimentele opstellingen in welke verschillende eiwitten van de CRISPR (met verschillende PAM afgeleid Requirements) worden gebruikt in combinatie.
In tegenstelling tot andere methoden, CORALINA genereert alle mogelijke gRNAs van de ingang DNA. Een nadeel van de methode is echter dat gRNAs ontbreekt de vereiste volgorde van de PAM zijn ook opgenomen in de bibliotheek, een functie die hij met een tweede enzymatische methode voor gRNA bibliotheek generatie, CRISPR-eten (tabel 1 deelt). De keuze van de ideale methode voor gRNA bibliotheek generatie is afhankelijk van de specificaties van de geplande screening experimenteren, met name de aard (genenreservoir, regelgevende, intergenic) en de grootte van de doel-regio (single locus, meerdere regio's, genoom-brede). We zien een speciale kop in met behulp van CORALINA wanneer een groot aantal niet-coderende of regelgevende regio's moeten worden geanalyseerd, als er onvolledig of onbetrouwbaar opeenvolgingsinformatie is (exotische modelsystemen, zaadmengsels van soorten (bijvoorbeeld microbiomes) of experimenteel verkregen input), verschillende CRISPR enzym worden gecombineerd of verzadigen van de analyse wordt uitgevoerd op een korte en gedefinieerde locus (bijvoorbeeld vertegenwoordigd door BACs).

De aanpassing van het bacteriële CRISPR/Cas9-systeem als een moleculaire targeting instrument veroorzaakt de meest recente revolutie in moleculaire biologie. Nooit eerder is het zo gemakkelijk te manipuleren van de chromatine op gedefinieerde genomic locaties geweest. Gemeenschappelijke toepassingen van CRISPR omvatten gerichte gen mutaties1, genoom engineering2, epigenome3, transcriptionele activering en gene silencing4bewerken. Een bijzonder voordeel van het CRISPR-systeem is dat de toepassingen niet beperkt tot goed bestudeerde kandidaat-sites zijn, zoals gRNA bibliotheken een minder vooringenomen schermen mogelijk maken. Dit vergemakkelijkt de ontdekking van functionele loci in het genoom zonder enige voorkennis van de experimentele. Echter gRNA bibliotheek bouw is momenteel grotendeels gebaseerd op oligo-nucleotide synthese, en er zijn beperkte opties voor de aankoop van gRNA Bibliotheken, die niet van de mens of muis oorsprong of doel gebieden buiten open lezen van frames. Dus, hoewel CRISPR schermen hebben bewezen ongelooflijk krachtig5,6,7,8, hun volledige potentieel heeft nog niet is geëxploiteerd.
Om te overwinnen de beperking van de klassieke gRNA generatie methoden twee strategieën zijn onlangs ontwikkeld. Beide zijn gebaseerd op de gecontroleerde enzymatische spijsvertering van DNA van het doel in plaats van te vertrouwen op aangepaste oligonucleotide synthese. Terwijl CORALINA9 werkzaam micrococcal nuclease, de enige momenteel beschikbare alternatieve methode, CRISPR-eten10, maakt gebruik van beperkingsenzymen (HpaII, ScrFI, Bfaik en Mmeik). Nog belangrijker is, kunnen beide technieken worden toegepast op elke input DNA, die als de bron van de opeenvolgingen van de protospacer van de gRNA fungeert. Terwijl de CRISPR-EATING methode maakt gebruik van een strategie om het aantal gekloonde gRNAs waarvan de targeting sites niet worden gevolgd door de vereiste S.pyogenes-PAM (protospacer aangrenzende motief) te verlagen, het slechts een klein deel van alle mogelijke functionele gRNAs voor genereert een bepaald gebied. CORALINA, aan de andere kant, kan voor het genereren van alle potentiële gRNAs voor de reeks van de bron, maar bevat ook een hogere Fractie van niet-functionele gidsen. gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit mogelijk maakt de productie van uitgebreide gRNA bibliotheken voor elke soort, elk Cas9-eiwit of -effector systeem op een eenvoudige en kosteneffectieve manier. CORALINA is bovendien aangepast aan aanpassen, zoals de juiste keuzes voor invoer- en vector definiëren de soort bibliotheek, de grootte en de inhoud. Hier, een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd dat kan worden gebruikt voor de generatie van uitgebreide gRNA bibliotheken uit verschillende bronnen van DNA (Figuur 1), met inbegrip van bacteriële kunstmatige chromosomen (BACs) of genomic DNA9. De representatieve resultaten bij dit protocol zijn afgeleid door de toepassing van het protocol van CORALINA tot DNA dat BAC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">500 mM EGTA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">03777-10G</td>
			<td style="width:272px;">1.4., Inactivation of Mnase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6678</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Gels, 20%, 10 well</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">EC6315BOX</td>
			<td style="width:272px;">2.1., pre-made 20 % PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">O&#39;RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">SM1303</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Running Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6675</td>
			<td style="width:272px;">2.1., PAGE gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Disposable scalpel, sterile</td>
			<td style="width:139px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:140px;">233-5363&#160;</td>
			<td style="width:272px;">2.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;"> 
			S9430</td>
			<td style="width:272px;">2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15593-031</td>
			<td style="width:272px;">3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycogen</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">10901393001</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">3M Sodium acetate , pH5.2</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">&#160; R1181</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:272px;">3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Quick blunting kit&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">E1201</td>
			<td style="width:272px;">4.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">ammomium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1542</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">magnesium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			M5661</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">&#160; MOLEM37465520 (or Promega V4231)</td>
			<td style="width:272px;">2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:139px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:140px;">A63881</td>
			<td style="width:272px;">5.3. + 6.5.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:139px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:140px;">28704</td>
			<td style="width:272px;">5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">concentrated T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">&#160;M0202T</td>
			<td style="width:272px;">6.1.+ 8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Long Amp Taq 2X Master Mix&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0287S</td>
			<td style="width:272px;">6.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0531S</td>
			<td style="width:272px;">5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">HindIII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0104S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">SacII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0157S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">AgeI</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0552S</td>
			<td style="width:272px;">8.2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Tris base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">2M MgCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">N0446S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">DTT</td>
			<td style="width:139px;">Sigam</td>
			<td style="width:140px;"> 
			DTT-RO</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">PEG-8000&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			P5413</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">NAD</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			N6522</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0363S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Phusion DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0530S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0208L</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">rSAP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0371S</td>
			<td style="width:272px;">8.3.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">TG1 competent cells</td>
			<td style="width:139px;">Lucigen</td>
			<td style="width:140px;">60502-1</td>
			<td style="width:272px;">9.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">1mm gap electroporation cuvettes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">732-2267&#160;</td>
			<td style="width:272px;">10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">DIS-988-010M&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S7653&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Bacto-tryptone</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">211705</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">212750</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Agar</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1296</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			G5516</td>
			<td style="width:272px;">9.17.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">MNAse</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>throughout</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micropulser</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>732-2267&#160;</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>9.1-9.9.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source

De populariteit van het systeem van de CRISPR/Cas9 voor zowel de genoom en de epigenome techniek komt voort uit haar eenvoud en aanpassingsvermogen. Een effector (de nuclease Cas9 of een fusieproteïne nuclease-dode dCas9) is gericht op een specifieke site in het genoom door een kleine synthetische RNA Absorbtion gids RNA, gRNA. De bipartiete aard van het CRISPR-systeem kan het gebruik ervan bij bevolkingsonderzoek benaderingen sinds plasmide bibliotheken met expressie cassettes van duizenden afzonderlijke gRNAs kunnen worden gebruikt om vele verschillende plaatsen in een enkele experiment ondervragen.
Tot op heden zijn gRNA sequenties voor de bouw van bibliotheken bijna uitsluitend gegenereerd door oligonucleotide synthese, die de grenzen van het haalbare complexiteit van sequenties in de bibliotheek en is relatief kostenintensieve. Hier zijn een gedetailleerd protocol voor CORALINA (uitgebreide gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit), een eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het genereren van zeer complexe gRNA bibliotheken gebaseerd op enzymatische spijsvertering van DNA input, is beschreven. Aangezien CORALINA bibliotheken kunnen worden gegenereerd vanaf een willekeurige bron van DNA, bestaat overvloed van opties voor aanpassingen, waardoor een grote verscheidenheid aan CRISPR gebaseerde schermen.

Met behulp van het protocol bij de hand, zijn CORALINA gRNA bibliotheken gegenereerd van mens en muis genomic DNA9 en BAC DNA (Figuur 1). Voor de productie van fragmenten van input DNA geschikt voor klonen in gRNA expressievectoren, moeten optimale omstandigheden voor gecontroleerde nuclease spijsvertering worden bepaald. Een typisch resultaat voor de optimalisatie van de micrococcal nuclease spijsvertering is afgebeeld in figuur 2A. Onvoldoende hoeveelheid nuclease (0,1, 2, 3, 4, 4,5 of 5 eenheden) produceert geen merkbare producten in het assortiment van de vereiste grootte (10-100 bp) en 5,5-7,5 eenheden nog steeds geproduceerd fragmenten die gemiddeld te lang zijn. Grotere hoeveelheden enzym (50 eenheden) leiden tot excessieve afbraak van input DNA na 10 min. Bijgevolg werd een tussenliggende bedrag (10 eenheden) gekozen. De digest werd opgeschaald te produceren genoeg verteerd fragmenten voor verdere reiniging en klonen (figuur 2B). Terwijl het is aanbevolen om blindelings DNA-fragmenten selecteren door grootte en alleen vertrouwen op de DNA-ladder voor oriëntatie te minimaliseren Gasbedwelming met behulp van DNA-fragmenten UV-licht, kunnen de gels daarna voor kwaliteitscontrole van de spijsvertering en snijden worden gekleurd. Figuur 2B toont een representatief voorbeeld van een pagina-gel uit waarin DNA fragmenten tussen 20 en 30 bp hebben is weggesneden. Gel gezuiverd MNase fragmenten werden geladen op een 20% pagina gel om succesvolle maat keuze en zuivering van MNase-verteerd fragmenten (figuur 2C) te controleren. Het protocol bij de hand is compatibel met het gebruik van aangepaste linker sequenties, toe te staan om een kloon van de MNase-verteerd fragmenten in gRNA expressievectoren van keuze. GRNA-PLKO-9 werd hier gebruikt als ruggengraat. De linkers worden versterkt uit de gRNA expressie vector gebruikt Standaardpcr. Figuur 2D beeldt een representatief voorbeeld van versterkte linker sequenties verstoken van extra, onjuiste of geen sjabloon waarbij. Vervolgens zijn linker waarbij verteerd met enzymen van de beperking om linkers op de MNase-verteerd fragmenten in de juiste richting als ligatuur zijn verbonden. Figuur 2D toont agarose gel van 5' en 3' linkers vóór en na de spijsvertering met HindIII en SacII respectievelijk, met vermelding van volledige spijsvertering van de linkers de voorspelde 637 en 295 bp. Het rechter gedeelte van de afbeelding van de gel documenteert de excisie van de verteerd linker fragmenten. Volgende gel extractie van verteerd linkers, de volgende stap in het protocol is de afbinding van linkers op de einde-gerepareerd MNase-verteerd fragmenten. Omdat het linker sequenties worden gegenereerd door PCR gebruikend unphosphorylated inleidingen, moet zelf Afbinding van linkers niet plaatsvinden. Alleen het einde herstelde MNase-verteerd DNA-fragmenten de fosfaat groepen nodig zijn voor de afbinding leveren. Na nick de vertaling, het product van de Afbinding wordt versterkt door PCR. Ter vermijding van buitensporige PCR versterking vooroordeel dat de vertegenwoordiging van de opeenvolgingen van het gRNA in de bibliotheek kan scheeftrekken, is versterking beperkt tot minder dan 20 cycli in totaal. Na PCR zijn de versterking producten moeilijk te visualiseren op agarose gel. Afzonderlijke schakelaar PCRs met 32 cycli worden daarom uitgevoerd om de producten te detecteren (maar niet worden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek). Resultaten van deze controle PCR worden weergegeven in figuur 2E. Hierdoor te optimaliseren de afbinding reacties en reacties zijn verstoken van PCR artefacten, die soms in "geen fragmenten controls voorkomen" (NFC). 2E figuur ziet u de gewenste amplicon (5' linker + fragment van DNA van 3' linker, lengte: 869 bp) volgende versterking van afbinding reacties met mengsel (1:1) verhoudingen tussen fragmenten en linker sequenties.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Figuur 1 : Voorgesteld tijdlijn voor het voorbereiden van een bibliotheek gRNA. CORALINA biedt een eenvoudige en kosten-efficiënte strategie voor de generatie van uitgebreide gRNA bibliotheken van een overvloed aan verschillende DNA-bronnen van elk organisme. Het protocol bij de hand kan worden gebracht tot voltooiing tijdens een werkweek. Linker generatie kan worden uitgevoerd in parallel met DNA einde-reparatie. Voorbereiding van electrocompetent bacteriën duurt twee dagen en omvat een overnachting groei stap en moet daarom worden gestart voordat de vergadering reacties zijn ingesteld. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Figuur 2 : Kritische stappen tijdens het protocol. (A) gecontroleerde spijsvertering van DNA van BAC kunt generatie van fragmenten van verschillende grootte. Hier afgebeeld is de optimalisatie van de MNase spijsvertering. Gezuiverde BAC DNA werd behandeld met verschillende hoeveelheden MNase voor 10 min. 10 U van MNase DNA-fragmenten van de gewenste lengte (20-30 bp) genereren. (B) het formaat van de selectie van fragmenten tussen 20 en 30 bp met behulp van excisie van polyacrylamide gels. Gezuiverde BAC DNA werd behandeld met 10 U van MNase gedurende 10 minuten. Het beeld werd opgenomen na excisie. (C) de controle van de kwaliteit van de gel-gezuiverd fragmenten. Na gel-zuivering, 1/6e van het gezuiverde MNase fragmenten pagina gel om succesvolle maat keuze en zuivering te controleren op een 20% werd geladen. (D) versterking van linker sequenties voor vergadering en restrictie-enzym vertering van linkers om directionele klonen. 5' en 3' linkers werden versterkt en snijd met HindIII en SacII, respectievelijk. No-template besturingselementen (NTC) werden opgenomen naar besturingselement voor PCR artefacten en verontreiniging van het DNA. Links: analytische voorbeeldtoepassing; rechts: preparatieve voorbeeldtoepassing. Beeld werd opgenomen na excisie van de gel. (E) succesvol Afbinding van linkers om DNA-fragmenten kan worden geanalyseerd met behulp van PCR met een toenemend aantal cycli van PCR (32) en gecontroleerd door controles, geen sjabloon met H2O (NTC) of met behulp van de NTC uit de voorgaande nick vertaling stap als input (NTC NT)). Het is belangrijk om op te nemen van een fragment oncontroleerbaar (NFC), wat een versterking van een afbinding en nick vertaling reactie waaruit de MNase fragmenten werden weggelaten. Alleen monsters in welke MNase fragmenten worden gecombineerd met linker DNA de verwachte amplicon produceren (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Methoden voor het opwekken van grootschalige gRNA bibliotheken moet eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief zijn. Beschrijven we een protocol voor de productie van gRNA bibliotheken gebaseerd op enzymatische spijsvertering van DNA van het doel. Deze methode, CORALINA (uitgebreide gRNA bibliotheek generatie via gecontroleerde nuclease activiteit) presenteert een alternatief voor dure aangepaste oligonucleotide synthese.

Een universeel Protocol voor grootschalige gRNA bibliotheek productie uit elke bron van DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Een aanpasbare Protocol voor String vergadering gRNA klonen (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Directe gen knock-out van Axolotl ruggenmerg neurale stamcellen via Elektroporation van CAS9 proteïne-gRNA complexen

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...