Name: a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
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Die Autoren möchten Prof. Dr. Stephan Beck und Prof. Dr. Magdalena Götz für ihre Beiträge danken, Hilfe und Unterstützung bei der Entwicklung der CORALINA Methode, Maximilian Wiessbeck und Valentin Baumann für die hilfreichen Kommentare. Die Arbeit wurde von der DFG (STR 1385/1-1) unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

CORALINA kann verwendet werden, um groß angelegte gRNA Bibliotheken durch kontrollierte Nuklease Verdauung der Ziel DNA zu generieren und bulk-Klonen von daraus resultierenden Doppel gestrandeten Fragmente. Statistische Inferenz zeigt, dass viele mehr als 107 individuelle gRNA Sequenzen bereits erfolgreich geklont wurden unter Verwendung des Protokolls bei Hand-9. CORALINA kann auf vielfältige Weise angepasst werden. Die Wahl der Schablone DNA definiert die Zielregion und die maximale Komplexität der generierten Bibliothek. Unter Verwendung dieses Protokolls, CORALINA Bibliotheken bisher von Menschen erzeugt wurden und die Maus genomischen DNS9. Repräsentative Ergebnisse zeigen die Generation einer CORALINA Bibliothek aus gereinigtem BAC-DNA. Weitere Anpassung kann durch die Wahl der gRNA Ausdruck Vektor und Linker Sequenzen erreicht werden. Wir haben bisher drei verschiedene Paare von Linker Längen für Gibson Montage mit kleinen Variationen in Effizienz9getestet.
Aufgrund ihrer Herkunft aus der Masse verdaut DNA Protospacer von CORALINA gRNAs sind in der Regel nicht genau 20 bp in Länge, sondern zeigen eine Längenverteilung mit einem Mittelwert, die beide hängt die Parameter der MNase Verdauung sowie die Größe der Exzision gemacht aus dem PAGE-Gel s. das repräsentative Beispiel in Abbildung 2 b und C, zeigt Fragmente mit einer mittleren Länge zwischen 19 und 27 bp. Nach unserer Erfahrung wird die Länge der Fragmente von der generierten gRNA Protospacer9treu bewahrt. Während Fragmente kürzer als 20 bp sollte vermieden werden, durch höhere Ziel-Rate von daraus resultierenden gRNAs, längere Fragmente sind wahrscheinlich viel weniger ein Problem für downstream-Anwendungen, da es wurde nachgewiesen, dass gRNAs mit Protospacers 45, solange bp sind noch funktionale9.
Die beiden wichtigsten Schritte im CORALINA Protokoll sind die Größenauswahl MNase verdaut Fragmente und Klonen Schritte. Generation von Fragmenten, die zu kurz sind (z. B. Durchschnitt unter 18 bp) oder Einbau von zu viele leere gRNA Expressionsvektoren wird die Bibliothek unbrauchbar. Daher ist es wichtig zu optimieren MNase Verdauung Schritt (Abbildung 2A), Exzision (Abb. 2 b, C) überwachen suchen komplette Verdauung gRNA Vektor Rückgrat und einschließlich keine Fragment-Kontrollen im gesamten Protokoll. Besondere Vorsicht ist auch zu ergreifen, um die Darstellung der gRNA Bibliothek zu bewahren. Ein gemeinsamer Engpass der Bibliothek-Generation ist im Allgemeinen die effiziente Übertragung der Plasmide in Bakterien für Verstärkung. So sind große Mengen von Bakterien mit hervorragenden Kompetenz und eine große Anzahl von einzelnen Elektroporation Veranstaltungen notwendig, um eine hohe Anzahl von gRNA Klone zu erreichen.
Neue Strategien für gRNA Bibliothek Produktion werden notwendig, um das volle Potenzial der CRISPR-basierten Screening Ansätze in den nächsten Jahrzehnten zu ernten. Es gibt eine erhebliche Nachfrage nach kostengünstigen, einfachen und anpassbare Methoden, um groß angelegte Bibliotheken erzeugen Voraussetzung Screening für eine größere Anzahl von Modellsystemen und CRISPR-basierten technischen Ansätze zugänglich zu machen. CORALINA bietet einen ersten Schritt in diese Richtung. Die Einsatzmöglichkeiten sind vielfältig, vor allem um umfassende Bibliotheken der Genome zu produzieren, cDNA-Bibliotheken seltener Modellsysteme, stark fokussierten Bibliotheken und Versuchsanordnungen in welche verschiedenen CRISPR-Proteine (mit unterschiedlichen PAM abgeleitet Anforderungen) werden in Kombination verwendet.
Im Gegensatz zu anderen Methoden erzeugt CORALINA alle möglichen gRNAs aus der Eingabe DNA. Ein Nachteil der Methode ist jedoch, dass gRNAs fehlt die erforderliche PAM Reihenfolge auch in der Bibliothek, ein Feature enthalten sind, die sie mit einer zweiten enzymatische Methode für gRNA Bibliothek Generation CRISPR-Essen (Tabelle 1) teilt. Die Wahl der idealen Methode für gRNA Bibliothek Generation hängt von den Vorgaben des geplanten Screenings experimentieren, vor allem die Natur (gen, intergenetischer) und die Größe der Zielregion (einzelne Locus, mehrere Regionen, genomweiten). Wir sehen ein besondere Vorteil bei der Verwendung von CORALINA wenn eine große Anzahl von nicht-kodierenden oder regulatorische Regionen sollen analysiert werden, ist unvollständig oder unzuverlässig Sequenzinformation (exotische Modellsysteme, Mischungen von Spezies (z.B. Mikrobiome) oder experimentell erhaltenen Eingang), wenn verschiedene CRISPR jedoch kombiniert werden oder Sättigung Analyse auf eine kurze und definiert (z. B. vertreten durch BACs) durchgeführt wird.

Die Anpassung des Systems der bakteriellen CRISPR/Cas9 als molekulare targeting-Tool verursacht die neueste Revolution in der molekularen Biologie. Noch nie war es so einfach, Chromatin an definierten genomische stellen zu manipulieren. Gemeinsame Anwendungen CRISPR gehören gezielt Gene Mutationen1, Genom engineering2, Epigenom Bearbeiten3, transkriptionelle Aktivierung und Gen-silencing-4. Ein besonderer Vorteil des CRISPR-Systems ist, dass seine Anwendungen nicht beschränkt auf gut untersuchte Kandidat Seiten sind wie gRNA Bibliotheken weniger voreingenommen Bildschirme ermöglichen. Diese erleichtern die Entdeckung der funktionalen Loci im Genom ohne experimentelle Vorkenntnisse. Jedoch gRNA Bibliotheksbau beruht derzeit überwiegend auf Oligo-Nukleotid-Synthese, und gibt es nur begrenzte Möglichkeiten, gRNA Bibliotheken zu kaufen, die nicht von Menschen oder Maus Ursprung oder Ziel Regionen außerhalb öffnen Frames lesen. So, obwohl CRISPR-Bildschirme bereits, unglaublich starke5,6,7,8 bewiesen haben, hat ihr volle Potenzial noch nicht ausgeschöpft.
Um zu überwinden haben vor kurzem die Begrenzung der klassischen gRNA Generation Methoden zwei Strategien entwickelt. Beide basieren auf kontrollierte enzymatische Verdauung der Ziel-DNA, anstatt auf benutzerdefinierte Oligonukleotid-Synthese. Während CORALINA9 micrococcal Nuklease, die nur derzeit verfügbaren alternative Methode CRISPR-Essen10, beschäftigt macht Gebrauch von Restriktionsenzymen (HpaII, ScrFich, Bfaich und Mmeich). Wichtig ist, können beide Techniken auf jede Eingabe DNA dient als die Quelle der gRNA Protospacer Sequenzen angewendet werden. Während der CRISPR-Essen-Methode eine Strategie setzt, um die Anzahl der geklonten gRNAs verringern deren targeting Standorte werden nicht durch die erforderlichen S.pyogenes PAM (Protospacer angrenzenden Motiv) gefolgt, es erzeugt nur einen kleinen Bruchteil aller möglichen funktionalen gRNAs für eine bestimmten Region. CORALINA, auf der anderen Seite ist in der Lage, alle möglichen gRNAs für der Quellsequenz zu generieren, sondern beinhaltet auch einen höheren Anteil nichtfunktionale Guides. gRNA Bibliothek Generation durch kontrollierte Nuklease Aktivität ermöglicht die Produktion von umfassenden gRNA Bibliotheken für irgendeine Sorte jedes Cas9-Protein oder -Effektor-System in eine einfache und kostengünstige Weise. Darüber hinaus ist CORALINA anpassbar an Anpassung, wie entsprechende Eingabe- und Vektor Entscheidungen der Bibliothekstyp, Größe und Inhalt zu definieren. Hier wird ein detailliertes Protokoll präsentiert, kann für die Generierung von umfassenden gRNA Bibliotheken aus verschiedenen Quellen der DNA (Abbildung 1), einschließlich bakterielle künstliche Chromosomen (BACs) oder genomische DNA-9verwendet werden. Die repräsentativen Ergebnisse begleiten dieses Protokolls wurden durch die Anwendung des Protokolls CORALINA BAC DNA abgeleitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">500 mM EGTA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">03777-10G</td>
			<td style="width:272px;">1.4., Inactivation of Mnase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6678</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Gels, 20%, 10 well</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">EC6315BOX</td>
			<td style="width:272px;">2.1., pre-made 20 % PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">O&#39;RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">SM1303</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Running Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6675</td>
			<td style="width:272px;">2.1., PAGE gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Disposable scalpel, sterile</td>
			<td style="width:139px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:140px;">233-5363&#160;</td>
			<td style="width:272px;">2.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;"> 
			S9430</td>
			<td style="width:272px;">2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15593-031</td>
			<td style="width:272px;">3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycogen</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">10901393001</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">3M Sodium acetate , pH5.2</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">&#160; R1181</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:272px;">3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Quick blunting kit&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">E1201</td>
			<td style="width:272px;">4.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">ammomium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1542</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">magnesium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			M5661</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">&#160; MOLEM37465520 (or Promega V4231)</td>
			<td style="width:272px;">2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:139px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:140px;">A63881</td>
			<td style="width:272px;">5.3. + 6.5.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:139px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:140px;">28704</td>
			<td style="width:272px;">5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">concentrated T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">&#160;M0202T</td>
			<td style="width:272px;">6.1.+ 8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Long Amp Taq 2X Master Mix&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0287S</td>
			<td style="width:272px;">6.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0531S</td>
			<td style="width:272px;">5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">HindIII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0104S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">SacII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0157S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">AgeI</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0552S</td>
			<td style="width:272px;">8.2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Tris base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">2M MgCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">N0446S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">DTT</td>
			<td style="width:139px;">Sigam</td>
			<td style="width:140px;"> 
			DTT-RO</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">PEG-8000&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			P5413</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">NAD</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			N6522</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0363S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Phusion DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0530S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0208L</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">rSAP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0371S</td>
			<td style="width:272px;">8.3.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">TG1 competent cells</td>
			<td style="width:139px;">Lucigen</td>
			<td style="width:140px;">60502-1</td>
			<td style="width:272px;">9.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">1mm gap electroporation cuvettes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">732-2267&#160;</td>
			<td style="width:272px;">10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">DIS-988-010M&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S7653&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Bacto-tryptone</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">211705</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">212750</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Agar</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1296</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			G5516</td>
			<td style="width:272px;">9.17.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">MNAse</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>throughout</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micropulser</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>732-2267&#160;</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>9.1-9.9.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source

Die Popularität des CRISPR/Cas9-Systems für Genom und Epigenom Technik ergibt sich aus seiner Einfachheit und Anpassungsfähigkeit. Ein Effektor (Cas9-Nuklease oder eine Nuklease-Toten dCas9-Fusionsprotein) richtet sich an eine bestimmte Stelle im Genom durch eine kleine synthetische RNA als Guide RNA oder gRNA bekannt. Die zweiseitigen Charakter des CRISPR-System ermöglicht seine Verwendung in screening-Ansätze seit Plasmid Bibliotheken mit Expressionskassetten von Tausenden von einzelnen gRNAs verwendet werden können, um viele verschiedene Websites in einem einzigen Experiment zu verhören.
Bislang wurden gRNA Sequenzen für den Bau von Bibliotheken fast ausschließlich durch Oligonukleotid-Synthese, generiert die begrenzt der erreichbaren Komplexität der Sequenzen in der Bibliothek und ist relativ kostenintensiv. Hier ein detailliertes Protokoll zum CORALINA (umfassende gRNA Bibliothek Generation durch kontrollierte Nuklease Aktivität), eine einfache und kostengünstige Methode zur Erzeugung von hochkomplexen gRNA Bibliotheken basierend auf enzymatische Verdauung der Eingabe DNA, wird beschrieben. Da CORALINA Bibliotheken aus jeder beliebigen Quelle der DNA erzeugt werden können, gibt es viele Möglichkeiten zur Individualisierung, ermöglichen eine Vielzahl von CRISPR-basierte Bildschirme.

Mit dem Protokoll zur hand, wurden CORALINA gRNA Bibliotheken aus Mensch und Maus genomische DNA-9 und BAC DNA (Abbildung 1) generiert. Um Fragmente der Eingabe DNA für Klonen in gRNA Expressionsvektoren geeignet zu produzieren, müssen optimale Bedingungen für die kontrollierte Nuklease Verdauung festgestellt werden. Ein typisches Ergebnis für die Optimierung der micrococcal Nuklease Verdauung ist in Abbildung 2Adargestellt. Unzureichende Menge an Nuklease (0,1, 2, 3, 4, 4,5 oder 5 Einheiten) produziert keine spürbare Produkte im Bereich erforderliche Größe (10-100 bp) und 5.5-7.5 Einheiten produziert noch Fragmente, die im Durchschnitt zu lang sind. Größere Mengen des Enzyms (50 Stück) führen zu einer übermäßigen Verschlechterung der Eingabe DNA nach 10 min. Infolgedessen wurde ein Zwischenbetrag (10 Stück) gewählt. Der Digest wurde skaliert, um genug erzeugen Fragmente für die anschliessende Reinigung und Klonen (Abb. 2 b) verdaut. Gele können danach für die Qualitätskontrolle der Verdauung und schneiden befleckt werden, obwohl empfohlen wird, wählen blind DNA-Fragmente durch Größe und nur auf der DNA-Leiter zur Orientierung zur Minimierung der Exposition von DNA-Fragmenten mit UV-Licht. Abbildung 2 b zeigt ein repräsentatives Beispiel für eine Seite-Gel aus der DNA Fragmente zwischen 20 und 30 bp herausgeschnitten worden haben. Gel gereinigt MNase Fragmente wurden auf 20 % geladen Seite Gel um erfolgreiche Größenauswahl und Reinigung des MNase verdaut Fragmente (Abbildung 2) zu prüfen. Das Protokoll zur hand ist kompatibel mit dem Einsatz von maßgeschneiderten Linker Sequenzen, ermöglicht die MNase verdaut Fragmente in gRNA Expressionsvektoren Wahl Klonen. GRNA PLKO9 diente hier als Rückgrat. Der Linker werden aus dem gRNA Ausdruck Vektor mit standard-PCR amplifiziert. Abb. 2D zeigt ein repräsentatives Beispiel für verstärkte Linker Sequenzen frei von zusätzlichen, falsche oder keine Vorlage Amplifikate. Als nächstes werden Linker Amplifikate verdaut mit Restriktionsenzymen um sicherzustellen, dass linker auf die MNase verdaut Fragmente in der richtigen Ausrichtung ligiert werden. Abb. 2D zeigt Agarose-Gele der 5' und 3' linker vor und nach der Verdauung mit HindIII und SacII bzw. komplette Verdauung der Linker die vorhergesagten 637 und 295 Angabe bp. Der rechten Teil des Gelbildes dokumentiert die Exzision der verdauten Linker Fragmente. Folgende gel Gewinnung von verdaute linker, der nächste Schritt des Protokolls ist die Unterbindung der Linker den Ende repariert MNase verdaut Fragmenten. Da Linker Sequenzen mittels PCR unter Verwendung unphosphorylated Zündkapseln erzeugt werden, sollte selbst Ligatur der Linker nicht auftreten. Nur die Ende repariert MNase verdaut DNA-Fragmente für Ligatur Phosphatgruppen liefern. Nach Nick Übersetzung ist die Ligatur-Produkt durch PCR verstärkt. Zur Vermeidung von übermäßigen PCR Verstärkung Voreingenommenheit, die die Darstellung der gRNA Sequenzen in der Bibliothek verzerren könnten, ist Verstärkung auf weniger als 20 Zyklen insgesamt beschränkt. Nach PCR sind die Amplifikationsprodukte schwer auf Agarose-Gele zu visualisieren. Separate Steuerung PCRs mit 32 Zyklen werden daher durchgeführt, um die Produkte zu erkennen (aber nicht für Bibliothek Vorbereitung verwendet werden). Ergebnisse aus diesem Steuerelement PCR sind in Abbildung 2Edargestellt. Dies ermöglicht die Ligatur Reaktionen zu optimieren und um sicherzustellen, dass Reaktionen frei von Artefakten, PCR, die manchmal, in "keine Fragmente Steuerelemente auftreten" (NFC). Abbildung 2E zeigt die gewünschten Amplikons (5' Linker + DNA-Fragment + 3' Linker, Länge: 869 bp) folgende Verstärkung der Ligatur Reaktionen durch äquimolaren (1:1) Verhältnisse zwischen Fragmenten und Linker Sequenzen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Abbildung 1 : Zeitplan für die Vorbereitung einer gRNA Bibliothek vorgeschlagen. CORALINA bietet eine einfache und kostengünstige Strategie zur Erzeugung von umfassenden gRNA Bibliotheken aus einer Vielzahl von verschiedenen DNA-Quellen von jedem Organismus. Das Protokoll zur hand kann zum Abschluss während einer Arbeitswoche gebracht werden. Linker-Generation kann parallel mit DNA-Ende-Reparatur durchgeführt werden. Vorbereitung von Electrocompetent Bakterien dauert zwei Tage und beinhaltet einen Übernachtung Wachstum Schritt und sollte daher vor der Montage, die Reaktionen eingerichtet sind gestartet werden. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Abbildung 2 : Kritische Schritte während des Protokolls. (A) geregelten Verdauung BAC DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe Generation ermöglicht. Hier dargestellt ist die Optimierung der MNase Verdauung. Gereinigte BAC-DNA wurde mit unterschiedlichen Mengen an MNase behandelt, für 10 min. 10 U MNase generieren DNA-Fragmente der gewünschten Länge (20-30 bp). (B) Größe Auswahl an Fragmente zwischen 20 und 30 bp mit Exzision von Polyacrylamid-Gele. Gereinigte BAC-DNA wurde mit 10 U MNase 10 min. lang behandelt. Das Bild wurde nach Exzision aufgenommen. (C) Qualitätskontrolle der Fragmente Gel gereinigt. Nach Gel-Reinigung 1/6 der gereinigten MNase Fragmente geladen wurde auf 20 % Seite Gel, erfolgreiche Größenauswahl und Reinigung zu überprüfen. (D) Verstärkung der Linker Sequenzen für Montage und Beschränkung Enzym Verdauung von linker gerichtete Klonen sicherzustellen. 5' und 3' linker wurden verstärkt und mit HindIII und SacII, bzw. geschnitten. No-Vorlagensteuerelemente (NTC) wurden aufgenommen, um Steuerung für PCR-Artefakte und DNA-Kontaminationen. Links: analytische Beispielanwendung; rechts: präparative Beispielanwendung. Bild wurde nach Gel Exzision aufgenommen. (E) erfolgreiche Unterbindung der Linker, DNA-Fragmente kann analysiert werden, mittels PCR mit einer erhöhten Anzahl von PCR-Zyklen (32) und durch keine Vorlage Kontrollen mit H2O (NTC) oder mit Hilfe den NTC aus dem vorherigen Nick Übersetzung Schritt kontrolliert als Input (NTC NT)). Es ist wichtig, eine keine Fragment-Kontrolle (NFC), die ist eine Verstärkung aus einer Ligatur und Nick Übersetzung Reaktion aus dem MNase Fragmente weggelassen wurden. Nur in welche MNase Fragmente mit Linker DNA kombiniert wurden Proben der erwarteten Amplikons produzieren (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Methoden zur Generierung von groß angelegten gRNA Bibliotheken sollte einfach, effizient und kostengünstig sein. Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung von gRNA Bibliotheken basierend auf enzymatische Verdauung von Ziel DNA. Diese Methode CORALINA (umfassende gRNA Bibliothek Generation durch kontrollierte Nuklease Aktivität) stellt eine Alternative zu teuren benutzerdefinierte Oligonukleotid-Synthese.

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Forschung

Genetik

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Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

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Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

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To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

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Direkter Gene Knock-out von Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

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Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

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