Name: a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

Forfatterne gjerne takke Prof. Dr. Stephan Beck og Prof. Dr. Magdalena Goetz for innspill, hjelp og støtte i å utvikle metoden CORALINA Maximilian Wiessbeck og Valentin Baumann for nyttige kommentarer. Arbeidet har blitt støttet av DFG (STR 1385/1-1).

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+profiles+to+function+in+epigenomics.">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORALINA:+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening.">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li><li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening.">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method.">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries.">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

CORALINA kan brukes til å generere storskala gRNA biblioteker av kontrollert nuclease fordøyelse av målet DNA og bulk kloning av resulterende dobbel strandet fragmenter. Statistisk inferens angir at mange mer enn 107 personlige gRNA sekvenser har allerede blitt er fullført ved hjelp av protokollen hånd9. CORALINA kan tilpasses på flere måter. Valg av mal DNA definerer målregion og maksimal kompleksiteten i genererte biblioteket. Bruker denne protokollen, CORALINA biblioteker har tidligere blitt generert fra menneske og mus genomisk DNA9. Representant resultatene presenteres her skildre generering av et CORALINA bibliotek fra renset BAC DNA. Videre tilpasning kan oppnås av gRNA uttrykk vektor og koblingsfunksjonalitet sekvenser. Vi har tidligere testet tre forskjellige par linker lengder for Gibson montering med små variasjoner i effektivitet9.
På grunn av deres opprinnelse fra bulk fordøyd DNA, protospacer av CORALINA gRNAs er vanligvis ikke nøyaktig 20 bp i lengde, men showet en lengde distribusjon med en mening som avhenger både parameterne for MNase fordøyelsen og størrelsen på excision laget siden gel s. representant eksemplet i figur 2B og Cviser fragmenter med median lengde mellom 19 og 27 bp. I vår erfaring beholdes trofast lengden av fragmenter av genererte gRNA protospacer9. Mens fragmenter kortere enn 20 bp bør unngås på grunn av høyere off-målet antall resulterende gRNAs, lengre fragmenter trolig mye mindre av et problem for nedstrøms programmer, siden det har vært vist at gRNAs med protospacers så lenge 45 bp er fortsatt funksjonell9.
De to viktigste trinnene i CORALINA protokollen er størrelse valg av MNase-fordøyd fragmenter og kloning skritt. Generasjon av fragmenter som er for kort (f.eks gjennomsnitt under 18 bp) eller inkorporering av mange tomme gRNA uttrykk vektorer vil gjøre biblioteket ubrukelig. Derfor er det viktig å optimalisere MNase fordøyelsen trinn (figur 2A), overvåke excision (figur 2B, C) sjekk for komplett fordøyelsen av gRNA vektor ryggraden og inkludert noen fragment kontroller i protokollen. Forsiktighet må også tas å bevare representasjon av gRNA biblioteket. En vanlig flaskehalsen biblioteket generasjon er generelt effektiv overføring av plasmider i bakterier for forsterkning. Dermed er store mengder bakterier med utmerket kompetanse og en rekke personlige electroporation hendelser nødvendig for å oppnå et høyt antall gRNA kloner.
Nye strategier for gRNA biblioteket produksjon vil være nødvendig å høste det fulle potensialet av CRISPR-basert screening de neste tiårene. Det er en betydelig etterspørsel etter kostnadseffektive, enkle og passelig metoder for å generere store biblioteker, nødvendig å gjøre screening mottakelig for et større antall modellsystemer og annet CRISPR engineering tilnærminger. CORALINA gir et første skritt mot denne. Potensielle bruker er mange, spesielt for å lage omfattende biblioteker av genomer, cDNA avledet biblioteker av mindre vanlige modellsystemer, svært fokusert biblioteker og eksperimentelle oppsetninger i hvilke ulike CRISPR proteiner (med ulike PAM krav) brukes i kombinasjon.
I motsetning til andre metoder genererer CORALINA alle mulige gRNAs fra input DNA. En ulempe metoden er imidlertid at gRNAs mangler nødvendig PAM sekvensen er også inkludert i biblioteket, en funksjon som den deler med en annen enzymatisk metode for gRNA biblioteket generasjon, CRISPR-spising (tabell 1). Valg av metoden ideelt for gRNA biblioteket generasjon avhenger av spesifikasjonene til planlagte screening eksperiment, spesielt natur (genic, regulatoriske, intergenisk) og størrelsen på målregion (enkelt locus, flere regioner, genomet-bred). Vi ser en spesiell opp ved CORALINA når et stort antall ikke-koding eller regulatoriske regioner er til å analysere, hvis det er ufullstendig eller upålitelig oppstartsrekkefølgen (eksotiske modellsystemer, blandinger av arter (f.eks microbiomes) eller eksperimentelt oppnådd inngang), hvis ulike CRISPR endonucleases kombineres eller mette analyse utføres på et kort og definert locus (f.eks representert ved BACs).

Tilpasning av bakteriell CRISPR/Cas9 som molekylær målretting verktøy forårsaket siste revolusjonen i molekylærbiologi. Aldri før har det vært så lett å manipulere chromatin definert genomisk steder. Vanlige programmer av CRISPR inkluderer målrettet genet mutasjoner1, genomet engineering2, epigenome3, transcriptional aktivisering og gene stanse4. En bestemt fordel av CRISPR er at deres programmer ikke er begrenset til godt studert kandidat nettsteder, som gRNA bibliotek gjør mindre partisk skjermer mulig. Disse lette oppdagelsen av funksjonelle loci i genomet uten forutgående eksperimentelle kunnskap. Men gRNA biblioteket konstruksjon er for tiden hovedsakelig basert på oligo-nukleotid syntese, og begrenset alternativer kjøpe gRNA biblioteker som ikke er menneske eller musen opprinnelse eller målet områder utenfor åpne lesing rammer. Dermed, selv om CRISPR skjermer har allerede vist seg utrolig potente5,6,7,8, fullt ut har ikke ennå blitt utnyttet.
For å overvinne begrensning av klassisk gRNA metoder to strategier har nylig blitt utviklet. Begge er basert på kontrollert enzymatisk fordøyelsen av målet DNA i stedet for å stole på egendefinerte oligonucleotide syntese. Mens CORALINA9 benytter micrococcal nuclease, bare tilgjengelig alternativ metoden CRISPR-spising10, gjør bruk av begrensning enzymer (HpaII, ScrFjeg, uteksaminertjeg og Mmejeg). Betydelig, kan begge teknikkene brukes på alle innspill DNA, som tjener som kilde til gRNA protospacer sekvenser. Mens metoden CRISPR-spising sysselsetter en strategi for å redusere antall klonet gRNAs som målretting nettsteder ikke er etterfulgt av den nødvendige S.pyogenes PAM (protospacer tilstøtende motiv), genereres bare en liten brøkdel av alle mulige funksjonelle gRNAs for en område. CORALINA, derimot, er i stand til å generere alle potensielle gRNAs for kilde sekvenser, men inkluderer også en høyere brøkdel av ikke-fungerende guider. gRNA bibliotek generasjon gjennom kontrollert nuclease aktivitet kan omfattende gRNA biblioteker for noen arter, alle Cas9-protein eller -effektor system på en enkel og kostnadseffektiv måte. Videre er CORALINA tilpasses tilpasning, som riktig inngang og vektor valg definerer biblioteket type, størrelse og innhold. Her en detaljert protokoll er presentert som kan brukes til generering av omfattende gRNA biblioteker fra ulike kilder av DNA (figur 1), inkludert bakteriell kunstig kromosomene (BBS) eller genomisk DNA9. Representant resultatene følger denne protokollen var avledet ved hjelp CORALINA protokollen BAC DNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">500 mM EGTA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">03777-10G</td>
			<td style="width:272px;">1.4., Inactivation of Mnase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6678</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Gels, 20%, 10 well</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">EC6315BOX</td>
			<td style="width:272px;">2.1., pre-made 20 % PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">O&#39;RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">SM1303</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Running Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6675</td>
			<td style="width:272px;">2.1., PAGE gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Disposable scalpel, sterile</td>
			<td style="width:139px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:140px;">233-5363&#160;</td>
			<td style="width:272px;">2.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;"> 
			S9430</td>
			<td style="width:272px;">2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15593-031</td>
			<td style="width:272px;">3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycogen</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">10901393001</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">3M Sodium acetate , pH5.2</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">&#160; R1181</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:272px;">3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Quick blunting kit&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">E1201</td>
			<td style="width:272px;">4.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">ammomium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1542</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">magnesium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			M5661</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">&#160; MOLEM37465520 (or Promega V4231)</td>
			<td style="width:272px;">2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:139px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:140px;">A63881</td>
			<td style="width:272px;">5.3. + 6.5.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:139px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:140px;">28704</td>
			<td style="width:272px;">5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">concentrated T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">&#160;M0202T</td>
			<td style="width:272px;">6.1.+ 8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Long Amp Taq 2X Master Mix&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0287S</td>
			<td style="width:272px;">6.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0531S</td>
			<td style="width:272px;">5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">HindIII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0104S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">SacII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0157S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">AgeI</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0552S</td>
			<td style="width:272px;">8.2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Tris base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">2M MgCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">N0446S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">DTT</td>
			<td style="width:139px;">Sigam</td>
			<td style="width:140px;"> 
			DTT-RO</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">PEG-8000&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			P5413</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">NAD</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			N6522</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0363S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Phusion DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0530S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0208L</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">rSAP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0371S</td>
			<td style="width:272px;">8.3.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">TG1 competent cells</td>
			<td style="width:139px;">Lucigen</td>
			<td style="width:140px;">60502-1</td>
			<td style="width:272px;">9.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">1mm gap electroporation cuvettes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">732-2267&#160;</td>
			<td style="width:272px;">10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">DIS-988-010M&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S7653&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Bacto-tryptone</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">211705</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">212750</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Agar</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1296</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			G5516</td>
			<td style="width:272px;">9.17.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">MNAse</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>throughout</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micropulser</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>732-2267&#160;</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>9.1-9.9.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source

Populariteten til CRISPR/Cas9 systemet for både genomet og epigenome engineering stammer fra dens enkelhet og tilpasningsevne. En effektor (Cas9-nuclease eller en nuclease-død dCas9 fusion protein) er rettet mot et bestemt område i genomet av en liten syntetiske RNA kjent som guide RNA, eller gRNA. Bipartite natur CRISPR systemet kan bruken screening tilnærminger siden plasmider biblioteker som inneholder uttrykket kassetter av individuelle gRNAs kan brukes til å forhøre mange forskjellige områder i et enkelt eksperiment.
Hittil er gRNA sekvenser for bygging av biblioteker nesten utelukkende generert av oligonucleotide syntese, som begrenser oppnåelig kompleksiteten i sekvenser i biblioteket og er relativt kostnadskrevende. Her en detaljert protokollen for CORALINA (omfattende gRNA biblioteket generasjon gjennom kontrollert nuclease aktivitet), en enkel og kostnadseffektiv metode for generering av komplekse gRNA biblioteker basert på enzymatisk fordøyelsen av input DNA, er beskrevet. Siden CORALINA biblioteker kan genereres fra enhver kilde av DNA, finnes mange alternativer for tilpasning, aktivere et stort utvalg av CRISPR-baserte skjermer.

Bruker protokollen for hånden, er CORALINA gRNA biblioteker generert fra menneskelige og mus genomisk DNA9 og BAC DNA (figur 1). For å produsere fragmenter av input DNA egnet for kloning i gRNA uttrykk vektorer, må optimale forhold for kontrollert nuclease fordøyelsen bestemmes. Et vanlig resultat for optimalisering av micrococcal nuclease fordøyelsen er avbildet i figur 2A. Utilstrekkelig mengde nuclease (0.1, 2, 3, 4, 4.5 eller 5 enheter) gir ingen merkbar produkter innenfor størrelse (10-100 bp) og 5.5-7.5 enheter fortsatt produsert fragmenter som er i gjennomsnitt for lang. Større mengder enzym (50 enheter) føre til overdreven nedverdigelsen inngang DNA etter 10 min. Derfor ble en mellomliggende beløpet valgt (10 enheter). Sammendraget ble skalert å produsere nok fordøyd fragmenter for påfølgende rensing og kloning (figur 2B). Mens det er anbefalt å blindt velger DNA fragmenter av størrelse og bare stole på DNA-stigen retning minimere eksponering av DNA UV lys, kan gels være farget etterpå for kvalitetskontroll av fordøyelsen og kutte. Figur 2B viser et representativt eksempel på en side gel fra som DNA fragmenter mellom 20 og 30 bp har vært excised. Gel renset MNase fragmenter ble lastet opp på 20% siden gel for å kontrollere vellykket størrelse og rensing av MNase-fordøyd fragmenter (figur 2C). Protokollen for hånden er kompatibel med bruk av tilpassede koblingsfunksjonalitet sekvenser, slik at for å klone MNase-fordøyd fragmenter i gRNA uttrykk vektorer valgfrihet. Her, ble gRNA-PLKO-9 brukt som ryggraden. Linkers er forsterket angrepsvektorene i gRNA-uttrykk ved hjelp av standard PCR. Figur 2D viser et representativt eksempel på forsterket koblingsfunksjonalitet sekvenser blottet for ekstra, feil eller ingen mal amplicons. Deretter er koblingsfunksjonalitet amplicons fordøyd med begrensning enzymer slik linkers er samskrevet på MNase-fordøyd fragmenter i riktig retning. Figur 2D viser agarose gelé av 5' og 3 linkers før og etter fordøyelsen HindIII og SacII, som angir fullstendig fordøyelsen av linkers de anslåtte 637 og 295 bp. Den høyre delen av gel bildet dokumenter eksisjon av fordøyd koblingsfunksjonalitet fragmenter. Følgende gel utvinning av fordøyd linkers er det neste trinnet i protokollen ligation av linkers til slutten-reparert MNase-fordøyd fragmenter. Fordi koblingsfunksjonalitet sekvenser genereres av PCR bruker unphosphorylated primere, skal selv ligation av linkers ikke oppstå. Bare slutten-reparert MNase-fordøyd DNA fragmenter gir fosfat gruppene nødvendig for hemorroider. Etter nick oversettelse, hemorroider produktet forsterkes av PCR. For å unngå overdreven PCR forsterkning skjevhet som kan gjøre representasjon av gRNA sekvenser i biblioteket, er forsterkning begrenset til mindre enn 20 sykluser totalt. Etter PCR er forsterkning produktene vanskelig å visualisere på agarose gels. Separate kontroll PCRene med 32 sykluser utføres derfor for å registrere produktene (men brukes ikke for biblioteket forberedelse). Resultatene fra denne kontrollen PCR vises i figur 2E. Dette gjør optimalisere ligation reaksjonene og sikre reaksjoner er blottet for PCR gjenstander, som skjer i "ingen fragmenter kontroller" (NFC). Figur 2E viser ønsket amplicon (5' linker + DNA fragment + 3 linker, lengde: 869 bp) etter forsterkning av hemorroider reaksjoner med ekvimolare (1:1) forhold mellom fragmenter og koblingsfunksjonalitet sekvenser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Figur 1 : Foreslo tidslinjen for å forberede en gRNA biblioteket. CORALINA tilbyr en enkel og kostnadseffektiv strategi for generering av omfattende gRNA biblioteker fra en mengde ulike DNA kilder fra en organisme. Protokollen for hånden kan bringes til ferdigstillelse i en arbeidsuke. Koblingsfunksjonalitet generasjon kan utføres parallelt med DNA slutten-reparasjon. Utarbeidelse av electrocompetent bakterier tar to dager og inkluderer en overnatting vekst skritt og bør derfor startes før montering reaksjoner er definert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Figur 2 : Avgjørende skritt i protokollen. (A) kontrollert fordøyelsen BAC DNA aktiverer generering av fragmenter av forskjellige størrelser. Vist her er optimalisering av MNase fordøyelsen. Renset BAC DNA ble behandlet med ulike mengder MNase for 10 min. 10 U av MNase generere DNA fragmenter av ønsket lengde (20-30 bp). (B) størrelse utvalg av fragmenter mellom 20 og 30 bp bruker excision fra polyakrylamid gels. Renset BAC DNA ble behandlet med 10 U MNase for 10 min. Bildet ble innspilt etter excision. (C) kvalitetskontroll av gel-renset. Etter gel-rensing, 1/6th av det renset MNase fragmenter ble lastet opp på 20% siden gel å sjekke vellykket størrelse og rensing. (D) forsterkning av koblingsfunksjonalitet sekvenser for montering og begrensning enzym fordøyelsen av linkers å sikre retningsbestemt kloning. 5' og 3 linkers ble forsterket og kuttet med HindIII og SacII, henholdsvis. No-mal kontroller (NTC) var inkludert å kontrollere for PCR gjenstander og DNA forurensning. Venstre: analytisk eksempelprogram; høyre: skytevåpen eksempelprogram. Bildet ble innspilt etter gel excision. (E) vellykket ligation av linkers DNA fragmenter kan analyseres bruker PCR med et økt antall PCR sykluser (32) og kontrollert av utfører ingen mal kontroller med H2O (NTC) eller bruke NTC i det forrige nick oversettelse inndata (NTC NT)). Det er viktig å inkludere et fragment valgfritt (NFC), som er en forsterkning fra en ligatur og nick oversettelse reaksjon som MNase fragmenter ble utelatt. Bare prøver i hvilke MNase fragmenter er kombinert med koblingsfunksjonalitet DNA produsere den forventede amplicon (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Metoder for å generere storskala gRNA biblioteker bør være enkel, effektiv og kostnadseffektiv. Vi beskriver en protokoll for produksjon av gRNA biblioteker basert på enzymatisk fordøyelsen av målet DNA. Denne metoden CORALINA (omfattende gRNA biblioteket generasjon gjennom kontrollert nuclease aktivitet) presenterer et alternativ til kostbar egendefinerte oligonucleotide syntese.

En universell protokoll for store gRNA biblioteket produksjon fra en DNA-kilde

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket konstruksjon for Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserte overuttrykte biblioteket Screening i gjær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

En passelig protokoll for streng montering gRNA kloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering av en Universal nestet omvendt transkripsjon polymerase Kjedere reaksjon for påvisning av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Direkte Gene knock-out av Axolotl spinal Cord nevrale stamceller via electroporation av CAS9 protein-gRNA komplekser

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

En fullstendig rørledning for isolere og sekvensering MicroRNAs, og analyserer seg benytter åpen kilde verktøy

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...