Name: a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить профессора д-ра Стефана Бек и профессор доктор Магдалена Гетц за их вклад, помощь и поддержку в разработке метода женский, Максимилиан Wiessbeck и Валентин Бауманн за полезные замечания. Работа была поддержана DFG (STR 1385/1-1).

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+profiles+to+function+in+epigenomics.">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORALINA:+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening.">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li><li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening.">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method.">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries.">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Женский может использоваться для создания больших масштабах gRNA библиотек, контролируемых нуклеиназы переваривания ДНАО цели и массовое клонирование фрагментов результирующего двойной мель. Статистический вывод показывает, что многие более чем 107 отдельных gRNA последовательностей уже были успешно клонирован рука9-протоколу. Женский можно настроить несколькими способами. Выбор шаблона ДНК определяет целевого региона и максимальной сложности созданного библиотеки. Используя этот протокол, женский библиотеки ранее были получены от человека и мыши геномной ДНК9. Представитель результаты, представленные здесь изображают поколения женский библиотеки из очищенного BAC ДНК. Дальнейшая настройка может быть достиган выбор gRNA выражение вектор и компоновщик последовательностей. Ранее мы проверили три разных пар компоновщика длин для Ассамблеи Гибсон с мало вариаций в эффективности9.
Из-за их происхождения от массовых переваривается ДНК, protospacer женский оформления, как правило, не точно 20 bp в длину, но показывают распределение длины с означает, что зависит как параметры MNase пищеварение, а также размер обрезания сделаны из геля страницы s. представителя пример, показанный на рисунке 2B и C, изображает фрагментов с Средний Длина между 19 и 27 bp. Наш опыт показывает длина фрагментов добросовестно сохраняется созданный gRNA protospacer9. Хотя фрагменты, короче, чем 20 bp следует избегать из-за выше от целевого показателя в результате оформления, больше фрагментов, вероятно, гораздо меньше, проблема для нисходящие приложения, так как он был показал что оформления с protospacers, пока 45 bp по-прежнему являются функциональные9.
Два наиболее важных шагов в протоколе женский являются выбор размера MNase переваривается фрагментов и клонирования шаги. Поколение фрагментов, которые являются слишком короткими (например в среднем ниже 18 bp) или включение слишком много пустых gRNA векторов выражения будет оказывать библиотека бесполезно. Таким образом важно оптимизировать шаг MNase пищеварения (рисунок 2A), для мониторинга эксцизии (Рисунок 2Б, C), проверьте для полного переваривания gRNA вектор позвоночника и включая контроль не фрагмент во всем протокол. Особое внимание также должно быть принято сохранить представление библиотеки gRNA. Один из распространенных узким библиотека поколения в целом является эффективной передачи плазмид в бактерии для амплификации. Таким образом большое количество бактерий с отличным компетентности и большое количество отдельных электропорации событий необходимы для достижения большого числа gRNA клонов.
Новые стратегии для производства gRNA библиотека будет необходимо собрать весь потенциал скрининга, основанный ТРИФОСФАТЫ подходов в течение следующих десятилетий. Существует значительный спрос на экономически эффективных, простых и настраиваемые методы для создания крупных библиотек, предпосылкой сделать скрининг поддаются большего числа типовых систем и различных основанный ТРИФОСФАТЫ инженерных подходов. Первым шагом к этому является предоставление женский. Потенциального использования коллектора, особенно для получения всеобъемлющей библиотеки геномов, cDNA полученных библиотек менее распространенные модели систем, целенаправленных библиотек и экспериментальных установок, в которых различные белки ТРИФОСФАТЫ (с разными Пэм требования) используются в сочетании.
В отличие от других методов женский генерирует все возможные оформления из входных данных ДНК. Однако недостатком метода является, что оформления, недостает необходимой последовательности PAM также включены в библиотеку, особенность, что он разделяет с второй ферментативного метода для gRNA библиотека поколения, ПИТАЮЩИХСЯ ТРИФОСФАТЫ (Таблица 1). Выбор идеальный метод для gRNA библиотека поколения зависит от характеристик планируемой проверки эксперимент, особенно природы (генно, нормативных, intergenic) и размер целевого региона (одном локусе, несколько регионов, геном общесистемной). Мы видим специального вверх в использовании женский, когда большое количество некодирующих или регулирования регионах должны быть проанализированы, если есть информация о неполной или ненадежной последовательности (экзотические модели систем, смеси видов (например , microbiomes) или экспериментально полученных входных данных), если разные ТРИФОСФАТЫ эндонуклеазами комбинируются или насыщения анализ выполняется на короткий и определенных локус (например представлены BACs).

Адаптация системы бактериальной ТРИФОСФАТЫ/Cas9 как инструмент молекулярной ориентации причиной последней революции в молекулярной биологии. Никогда не было так легко манипулировать хроматина в определенных местах генома. Общие приложения ТРИФОСФАТЫ включают целевые ген мутации1, геном инженерных2, epigenome3, transcriptional активации и4экспрессию гена редактирования. Один особым преимуществом ТРИФОСФАТЫ системы является, что ее применения изученной кандидат сайтов, не ограничены как gRNA библиотеки сделать менее предвзято экраны можно. Они облегчают открытие функционального локусов генома без каких-либо предварительных знаний экспериментальной. Однако gRNA библиотека строительство в настоящее время главным образом основывается на oligo нуклеотидного синтеза и существуют ограниченные возможности для приобретения gRNA библиотек, которые не являются человека или мыши происхождения или целевые регионы за пределами открыть чтения фреймов. Таким образом хотя ТРИФОСФАТЫ экраны уже доказали невероятно мощным5,6,7,8, их полный потенциал не еще не использовалась.
Чтобы преодолеть ограничение классической gRNA поколения методы две стратегии недавно был разработан. Обе они основаны на контролируемых ферментативного пищеварения целевой ДНК, вместо того чтобы полагаться на пользовательских олигонуклеотида синтеза. Хотя женский9 использует Микрококковая Нуклеаза, в настоящее время доступна только альтернативный метод, ТРИФОСФАТЫ-есть10, позволяет использовать энзимы ограничения (HpaII, ScrFя, БФАя и Mmeя). Важно отметить, что оба методы могут применяться к любой входной ДНК, которая служит источником gRNA protospacer последовательностей. В то время как метод еды ТРИФОСФАТЫ использует стратегию для уменьшения числа клонированных оформления сайтов которых таргетинга не следуют необходимые все PAM (protospacer прилегающие мотив), он генерирует только небольшая часть всех возможных функционального оформления для данного региона. ЖЕНСКИЙ, с другой стороны, способен генерировать все потенциальные оформления для исходной последовательности, но также включает в себя выше часть нефункциональные гидов. gRNA библиотека поколения через контролируемые нуклеиназы деятельности позволяет производство всеобъемлющей gRNA библиотек для любого вида, любого Cas9-белка или - эффекторные системы простой и экономически эффективным образом. Кроме того женский приспособлена для настройки, как соответствующие ввода и вектора выбора определяют тип библиотеки, размер и содержание. Здесь, который представлен подробный протокол может использоваться для формирования всеобъемлющих gRNA библиотек из различных источников ДНК (рис. 1), включая бактериальных искусственных хромосом (BACs) или геномной ДНК9. Представитель результаты, сопровождающих этот протокол были получены путем применения протокола женский BAC ДНК.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">500 mM EGTA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">03777-10G</td>
			<td style="width:272px;">1.4., Inactivation of Mnase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6678</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Gels, 20%, 10 well</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">EC6315BOX</td>
			<td style="width:272px;">2.1., pre-made 20 % PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">O&#39;RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">SM1303</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Running Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6675</td>
			<td style="width:272px;">2.1., PAGE gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Disposable scalpel, sterile</td>
			<td style="width:139px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:140px;">233-5363&#160;</td>
			<td style="width:272px;">2.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;"> 
			S9430</td>
			<td style="width:272px;">2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15593-031</td>
			<td style="width:272px;">3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycogen</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">10901393001</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">3M Sodium acetate , pH5.2</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">&#160; R1181</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:272px;">3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Quick blunting kit&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">E1201</td>
			<td style="width:272px;">4.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">ammomium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1542</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">magnesium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			M5661</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">&#160; MOLEM37465520 (or Promega V4231)</td>
			<td style="width:272px;">2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:139px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:140px;">A63881</td>
			<td style="width:272px;">5.3. + 6.5.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:139px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:140px;">28704</td>
			<td style="width:272px;">5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">concentrated T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">&#160;M0202T</td>
			<td style="width:272px;">6.1.+ 8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Long Amp Taq 2X Master Mix&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0287S</td>
			<td style="width:272px;">6.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0531S</td>
			<td style="width:272px;">5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">HindIII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0104S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">SacII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0157S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">AgeI</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0552S</td>
			<td style="width:272px;">8.2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Tris base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">2M MgCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">N0446S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">DTT</td>
			<td style="width:139px;">Sigam</td>
			<td style="width:140px;"> 
			DTT-RO</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">PEG-8000&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			P5413</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">NAD</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			N6522</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0363S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Phusion DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0530S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0208L</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">rSAP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0371S</td>
			<td style="width:272px;">8.3.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">TG1 competent cells</td>
			<td style="width:139px;">Lucigen</td>
			<td style="width:140px;">60502-1</td>
			<td style="width:272px;">9.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">1mm gap electroporation cuvettes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">732-2267&#160;</td>
			<td style="width:272px;">10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">DIS-988-010M&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S7653&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Bacto-tryptone</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">211705</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">212750</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Agar</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1296</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			G5516</td>
			<td style="width:272px;">9.17.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">MNAse</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>throughout</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micropulser</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>732-2267&#160;</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>9.1-9.9.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source

Популярность ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы для генома и epigenome техники проистекает из его простоту и технологичность. Эффектор (Cas9 Нуклеаза или нуклеиназы Мертвое dCas9 синтез белка) ориентирован на определенный сайт в геноме небольшой синтезированную РНК, известный как руководство РНК, или gRNA. Двусторонний характер системы ТРИФОСФАТЫ позволяет его использовать в скрининг подходы с плазмида библиотек, содержащих выражение кассеты тысяч отдельных оформления может использоваться допросить много различных сайтов в одном эксперименте.
На сегодняшний день, gRNA последовательности для строительства библиотек был почти исключительно порожденных синтеза олигонуклеотида, который ограничивает достижимых сложность последовательностей в библиотеке и относительно дорогостоящими. Здесь подробный протокол для женский (библиотека поколения всеобъемлющей gRNA через контролируемые нуклеиназы деятельности), простой и эффективный метод для поколения весьма сложные gRNA библиотек на основе ферментативного пищеварения ввода ДНК, описано. Поскольку женский библиотеки могут быть созданы из любого источника ДНК, множество опций для настройки существуют, что позволяет большое разнообразие основанный ТРИФОСФАТЫ экранов.

С помощью протокола под рукой, женский gRNA библиотеки были получены от человека и мыши, геномной ДНК9 и дна BAC (рис. 1). Для получения фрагментов ввода ДНК для клонирования в векторы выражения gRNA, оптимальные условия для контролируемых нуклеиназы пищеварение должны определяться. Типичный результат для оптимизации Микрококковая Нуклеаза пищеварение изображен на рисунке 2A. Недостаточное количество нуклеиназы (0,1, 2, 3, 4, 4,5-5 единиц) производит не заметно продукции в пределах требуемого размера (10-100 bp) и 5,5-7,5 подразделения по-прежнему производится фрагменты, которые находятся на среднем слишком долго. Большее количество фермента (50 единиц) привести к чрезмерной деградации входных данных ДНК после 10 мин. Следовательно промежуточные объем был выбран (10 единиц). Дайджест была расширена производить достаточно переваривается фрагменты для последующей очистки и клонирования (рис. 2B). Хотя это рекомендуется слепо выбирать фрагменты ДНК по размеру и полагаться только на лестнице ДНК для ориентации для сведения к минимуму воздействия фрагментов ДНК УФ света, гели можно потом витражи для контроля качества пищеварения и резки. Рисунок 2B показывает репрезентативного примера страницы геля, из которых ДНК была иссечена фрагменты между 20 и 30 bp. Гель очищенный MNase фрагменты были погружены на 20% гель страницы для проверки успешного размер выделения и очистки MNase переваривается фрагментов (рис. 2 c). Протокол рукой совместим с использованием настраиваемых компоновщика последовательностей, позволяя клонировать MNase переваривается фрагменты в gRNA векторы выражения выбора. Здесь gRNA-PLKO9 был использован как основа. Линкеры усиливаются от вектора выражения gRNA, используя стандартное PCR. 2D рисунок изображает репрезентативного примера усиливается компоновщика последовательности лишена дополнительных, неправильный или не ампликонов шаблон. Затем компоновщик ампликонов усваиваются с энзимами ограничения для обеспечения что линкеры лигируют на MNase переваривается фрагментов в правильной ориентации. 2D рисунок показывает Гели агарозы 5' и 3' линкеры до и после переваривания ХиндIII и SacII соответственно, указав полное переваривание линкеры предсказал 637 и 295 bp. Правая часть геля изображения документов иссечение переваривается компоновщика фрагментов. После гель добыча переваривается компоновщики, следующий шаг в протоколе — перевязка линкеры фрагменты отремонтированы конец MNase переваривается. Потому что компоновщик последовательностей создаются с использованием unphosphorylated праймеры PCR, самолигирование линкеры не должно происходить. Только конец ремонт MNase переваривается фрагментов ДНК обеспечивают фосфатные группы, необходимые для перевязки. После перевода Ник продукт перешнуровки усиливается ПЦР. Для того, чтобы избежать чрезмерного смещения амплификации PCR, которые могут исказить представление gRNA последовательностей в библиотеке, усиление ограничивается менее 20 циклов в общей сложности. После ПЦР усиление продукции трудны для визуализации на гелях агарозы. PCR отдельный элемент управления с 32 циклы таким образом выполняются для выявления продукции (но не используются для приготовления библиотека). Результаты из этого элемента управления ПЦР показаны на рисунке 2E. Это позволяет оптимизировать реакции перешнуровки и для обеспечения реакции лишены ПЦР артефакты, которые иногда имеют место в «без элементов управления фрагменты» (NFC). 2E рисунок показывает нужный ампликон (5' компоновщика + фрагмент ДНК + 3' компоновщика, длина: 869 bp) после усиления лигирование реакций с помощью эквимолярных соотношения (1:1) фрагменты и компоновщик последовательности.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Рисунок 1 : Предложил сроки для подготовки библиотеки gRNA. Женский предлагает простой и экономичной стратегии для создания всеобъемлющей gRNA библиотек из множества различных источников ДНК от любого организма. Протокол под рукой может быть доставлен завершения в течение одной рабочей недели. Компоновщик поколения могут выполняться параллельно с конца репарации ДНК. Подготовка electrocompetent бактерий занимает два дня и включает в себя ночь шаг роста и поэтому должен быть запущен перед Ассамблеей, которые настроены реакции. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Рисунок 2 : Критические шаги во время протокол. (A) контролируемых пищеварение BAC ДНК позволяет поколение фрагментов разных размеров. Здесь показан оптимизации MNase пищеварение. Очищенная ДНК BAC лечился с различными объемами MNase за 10 минут 10 U MNase генерировать фрагменты ДНК желаемой длины (bp 20-30). (B) размер выделения фрагментов между 20 и 30 bp, используя иссечение от полиакриламидных гелей. Очищенная ДНК BAC лечили 10 U MNase за 10 мин. Изображение было записано после обрезания. Контроль качества (C) гель очищенная фрагментов. После гель очищение 1/6 из очищенного MNase фрагменты страницы гель для проверки успешного размер выделения и очистки была погружена на 20%. (D) амплификация последовательностей компоновщик для Ассамблеи и энзима ограничения пищеварение линкеры обеспечить дирекционного клонирования. 5' и 3' линкеры были усилены и сократить с HindIII и SacII, соответственно. No шаблон элементов управления (NTC) были включены в элемент управления для ПЦР артефактов и ДНК загрязнения. Слева: пример аналитическое приложение; справа: препаративные образца приложения. Изображение было записано после иссечения гель. (E) успешно лигирование линкеры фрагментов ДНК могут быть проанализированы с помощью ПЦР с возросшим числом циклов PCR (32) и контролируется выполнение без шаблона элементов управления с H2O (NTC) или с помощью НПС на предыдущем шаге Ник перевод вход (NTC NT)). Важно включить элемент не фрагмент управления (NFC), который является усиление от перевязки и перевод реакции Ник, из которого были опущены фрагменты MNase. Только образцы, в которых MNase фрагменты были объединены с компоновщик ДНК производить ожидаемых ампликон (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Методы для создания крупномасштабных gRNA библиотек должна быть простой, эффективной и рентабельной. Мы описываем протокол для производства gRNA библиотек на основе ферментативного пищеварения ДНАО цели. Этот метод, женский (всеобъемлющий gRNA библиотека поколения через контролируемые нуклеиназы деятельности) представляет альтернатива дорогостоящим пользовательских олигонуклеотида синтеза.

Универсальный протокол для крупномасштабных gRNA библиотека производства из любого источника ДНК

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Сверхнизкое ввода геном последовательность подготовки библиотеки от Tardigrade единичная

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

На основе спаривания гиперэкспрессия библиотека скрининга в дрожжи

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Настраиваемый протокол для строки Ассамблеи gRNA клонирование (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Оценка универсального вложенного обратного транскрипционного цепной реакции для обнаружения Лисовивирусов

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Прямой ген knock-out аксолотла спинного мозга нейронных стволовых клеток через Электропорации CAS9 Белковые-gRNA комплексов

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Полный трубопровод для изоляции и секвенирования микроРНК и анализа их с помощью инструментов с открытым исходным кодом

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...