Name: a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

Författarna vill tacka Prof. Dr. Stephan Beck och Prof. Dr Magdalena Goetz för deras insats, hjälp och stöd i att utveckla metoden CORALINA, Maximilian Wiessbeck och Valentin Baumann för hjälpsamma kommentarer. Arbetet har stötts av DFG (STR 1385/1-1).

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+profiles+to+function+in+epigenomics.">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORALINA:+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening.">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li><li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening.">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method.">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries.">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

CORALINA kan användas för att generera stor skala gärna bibliotek genom kontrollerad nuclease-nedbrytning av mål-DNA och bulk kloning av resulterande dubbel strandsatta fragment. Statistisk inferens indikerar att många fler än 107 individuella gärna sekvenser har redan varit framgångsrikt klonat använder protokollet vid hand9. CORALINA kan anpassas på flera sätt. Valet av DNA-templat definierar målregionen och maximal komplexiteten i det genererade biblioteket. Användning av detta protokoll, CORALINA bibliotek tidigare har genererats från människa och mus genomiskt DNA9. Representativa resultat presenteras här skildrar generering av ett CORALINA bibliotek från renat BAC DNA. Ytterligare anpassning kan uppnås genom valet av gärna uttryck vektor och linker sekvenser. Vi har tidigare testat tre olika par linker längder för Gibson montering med små variationer i effektivitet9.
På grund av deras ursprung från bulk rötas DNA, protospacer av CORALINA gRNAs är oftast inte exakt 20 bp i längd, men Visa en längd fördelning med ett medelvärde som beror både på parametrarna för MNase matsmältningen samt storleken på excision görs från sidan gelen s. representativa exemplet i figur 2B och C, skildrar fragment med en median längd mellan 19 och 27 bp. Vår erfarenhet bevaras troget längden av fragment av den genererade gärna protospacer9. Medan fragment kortare än 20 bp bör undvikas på grund av högre off-target resulterande gRNAs, längre fragment är sannolikt mycket mindre av ett problem för nedströms tillämpningar, eftersom det har visat att gRNAs med protospacers så länge som 45 bp är fortfarande funktionella9.
De två mest kritiska steg i protokollet CORALINA är storlek val av MNase-rötas fragment och kloning steg. Generation av fragment som är för korta (e.g. genomsnittet under 18 bp) eller införlivandet av alltför många tomma gärna uttryck vektorer kommer att göra biblioteket värdelös. Därför är det viktigt att optimera steget MNase matsmältning (figur 2A), att övervaka excision (figur 2B, C), kontrollera för fullständig nedbrytning av gärna vektor ryggraden och inklusive inga fragment kontroller i hela protokollet. Särskild omsorg måste också vidtas för att bevara framställningen av gärna biblioteket. En gemensam flaskhalsen i biblioteket generation är i allmänhet effektiv överföring av plasmider in bakterier för förstärkning. Således, stora mängder bakterier med utmärkt kompetens och ett stort antal enskilda elektroporation händelser är nödvändigt för att uppnå ett högt antal gärna kloner.
Nya strategier för gärna biblioteket produktion kommer att vara nödvändigt att skörda den fulla potentialen av CRISPR-baserad screening metoder under de kommande decennierna. Det finns en betydande efterfrågan på kostnadseffektiva, enkla och anpassningsbara metoder att generera storskalig bibliotek, en förutsättning att göra screening kan bli föremål för ett större antal modellsystem och olika CRISPR-baserade engineering tillvägagångssätt. CORALINA tillhandahåller ett första steg mot detta. De potentiella användningsområdena är många, särskilt för att producera omfattande bibliotek av genomen, cDNA härrör bibliotek av mindre vanliga modellsystem, mycket fokuserad bibliotek och experimentella uppställningar i vilka olika CRISPR-proteiner (med olika PAM krav) används i kombination.
Till skillnad från andra metoder genererar CORALINA alla möjliga gRNAs från ingången DNA. En nackdel med metoden är dock att gRNAs saknar sekvensen som behövs PAM ingår också i biblioteket, en funktion som den delar med en andra enzymatisk metod för gärna biblioteket generation, CRISPR-ätande (tabell 1). Valet av den idealiska metoden för gärna biblioteket generation beror på specifikationerna för planerade screeningen experimentera, särskilt natur (genic, tillsyn, intergenic) och storlek av målregionen (single locus, flera regioner, genome-wide). Vi ser en särskild upp i använda CORALINA när ett stort antal icke-kodande eller regulatoriska regioner skall analyseras, om det finns ofullständiga eller otillförlitliga sekvensinformation (exotiska modellsystem, blandningar av arter (t.ex. microbiomes) eller experimentellt erhållna ingång), om olika CRISPR endonucleases kombineras eller om mättar analys utförs på ett kort och definierade locus (e.g. representeras av BACs).

Anpassning av det bakteriella CRISPR/Cas9-systemet som en molekylär inriktning verktyg orsakade den senaste revolutionen i molekylärbiologi. Aldrig tidigare har det varit så lätt att manipulera kromatin på definierade genomisk platser. Vanliga tillämpningar av CRISPR inkluderar riktade genen mutationer1, genomet engineering2, epigenomet redigera3, transkriptionell aktivering och nedtystning4. En särskild fördel med CRISPR systemet är att dess tillämpningar inte är begränsat till väl studerat kandidat platser, som gärna bibliotek gör mindre partisk skärmar möjligt. Dessa underlättar upptäckten av funktionella loci i genomet utan några experimentella förkunskaper. Dock gärna biblioteket konstruktion är för närvarande mestadels baserad på oligo-nukleotid syntes, och det finns begränsade alternativ att köpa gärna bibliotek som inte är av mänskliga eller mus ursprung eller mål regioner utanför öppna läsning ramar. Således, även om CRISPR skärmar har redan visat sig otroligt potent5,6,7,8, sin fulla potential har ännu inte har utnyttjats.
För att övervinna begränsning av klassiskt gärna generation metoder två strategier har nyligen utvecklats. Båda är baserade på kontrollerade enzymatisk nedbrytning av målet DNA i stället för att förlita sig på anpassade oligonukleotiden syntes. Medan CORALINA9 sysselsätter micrococcal nuclease, endast tillgängliga alternativa metoden, CRISPR-äta10, använder sig av restriktionsenzym (HpaII, ScrFI, Bfajag och Mmejag). Ännu viktigare, kan båda teknikerna tillämpas på alla ingående DNA, som fungerar som källa av gärna protospacer sekvenser. Medan metoden CRISPR-ätande sysselsätter en strategi för att minska antalet klonade gRNAs vars inriktning platser inte följs av krävs S.pyogenes PAM (protospacer angränsande motiv), det genererar bara en bråkdel av alla möjliga funktionell gRNAs för en viss region. CORALINA, däremot, kan generera alla potentiella gRNAs för sekvensen källa, men innehåller också en högre andel av icke-funktionella guider. Gärna biblioteket generation genom kontrollerad nuclease aktivitet möjliggör produktion av omfattande gärna bibliotek för alla arter, alla Cas9-protein eller -effektor system på ett enkelt och kostnadseffektivt sätt. Dessutom är CORALINA anpassningsbar till anpassning, som lämpliga indata och vektor val definiera bibliotek typ, storlek och innehåll. Här presenteras ett detaljerat protokoll som kan användas för generering av omfattande gärna bibliotek från olika källor av DNA (figur 1), inklusive bakteriella artificiella kromosomer (BACs) eller genomisk DNA9. De representativa resultat som åtföljer detta protokoll härleddes genom att tillämpa protokollet CORALINA BAC DNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">500 mM EGTA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">03777-10G</td>
			<td style="width:272px;">1.4., Inactivation of Mnase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6678</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Gels, 20%, 10 well</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">EC6315BOX</td>
			<td style="width:272px;">2.1., pre-made 20 % PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">O&#39;RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">SM1303</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Running Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6675</td>
			<td style="width:272px;">2.1., PAGE gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Disposable scalpel, sterile</td>
			<td style="width:139px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:140px;">233-5363&#160;</td>
			<td style="width:272px;">2.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;"> 
			S9430</td>
			<td style="width:272px;">2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15593-031</td>
			<td style="width:272px;">3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycogen</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">10901393001</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">3M Sodium acetate , pH5.2</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">&#160; R1181</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:272px;">3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Quick blunting kit&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">E1201</td>
			<td style="width:272px;">4.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">ammomium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1542</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">magnesium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			M5661</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">&#160; MOLEM37465520 (or Promega V4231)</td>
			<td style="width:272px;">2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:139px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:140px;">A63881</td>
			<td style="width:272px;">5.3. + 6.5.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:139px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:140px;">28704</td>
			<td style="width:272px;">5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">concentrated T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">&#160;M0202T</td>
			<td style="width:272px;">6.1.+ 8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Long Amp Taq 2X Master Mix&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0287S</td>
			<td style="width:272px;">6.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0531S</td>
			<td style="width:272px;">5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">HindIII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0104S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">SacII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0157S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">AgeI</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0552S</td>
			<td style="width:272px;">8.2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Tris base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">2M MgCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">N0446S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">DTT</td>
			<td style="width:139px;">Sigam</td>
			<td style="width:140px;"> 
			DTT-RO</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">PEG-8000&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			P5413</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">NAD</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			N6522</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0363S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Phusion DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0530S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0208L</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">rSAP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0371S</td>
			<td style="width:272px;">8.3.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">TG1 competent cells</td>
			<td style="width:139px;">Lucigen</td>
			<td style="width:140px;">60502-1</td>
			<td style="width:272px;">9.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">1mm gap electroporation cuvettes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">732-2267&#160;</td>
			<td style="width:272px;">10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">DIS-988-010M&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S7653&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Bacto-tryptone</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">211705</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">212750</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Agar</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1296</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			G5516</td>
			<td style="width:272px;">9.17.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">MNAse</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>throughout</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micropulser</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>732-2267&#160;</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>9.1-9.9.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source

Populariteten av CRISPR/Cas9 systemet för både genomet och epigenomet teknik härrör från dess enkelhet och anpassningsförmåga. En effektor (den Cas9 nuclease eller ett nuclease-döda dCas9 fusionsprotein) riktas till en specifik plats i genomet av en liten syntetisk RNA kallas för guide RNA, eller gärna. Bipartit beskaffenhet CRISPR systemet gör det möjligt för dess användning i screening metoder sedan plasmid bibliotek innehållande uttryck kassetter av tusentals enskilda gRNAs kan användas för att förhöra många olika webbplatser i ett enda experiment.
Hittills har har gärna sekvenser för byggandet av biblioteken genererats nästan uteslutande av oligonukleotiden syntes, som begränsar genomförbara komplexiteten i sekvenser i biblioteket och är förhållandevis kostnadsintensiv. Här ett detaljerat protokoll för CORALINA (omfattande gärna biblioteket generationen genom kontrollerad nuclease aktivitet), en enkel och kostnadseffektiv metod för generering av mycket komplexa gärna bibliotek baserat på enzymatisk nedbrytning av tillförda DNA, beskrivs. Eftersom CORALINA bibliotek kan genereras från någon källa av DNA, finns gott om alternativ för anpassning, möjliggör ett stort utbud av CRISPR-baserade skärmar.

Använder protokollet till hands, har CORALINA gärna bibliotek genererats från människa och mus genomisk DNA9 och BAC DNA (figur 1). För att producera fragment av ingående DNA lämplig för kloning i gärna uttryck vektorer, har optimala förutsättningar för kontrollerad nuclease-nedbrytning skall fastställas. Ett typiskt resultat för optimering av micrococcal nuclease-nedbrytning avbildas i figur 2A. Otillräcklig mängd nuclease (0,1, 2, 3, 4, 4,5 eller 5 enheter) producerar ingen märkbar produkter i intervallet krävs storlek (10-100 bp) och 5,5-7,5 enheter produceras fortfarande fragment som är i genomsnitt för lång. Större mängder enzym (50 enheter) leda till kraftig försämring av input DNA efter 10 min. Därför valdes ett mellanliggande belopp (10 enheter). Digest var skalas upp för att producera tillräckligt rötas fragment för efterföljande rening och kloning (figur 2B). Även om det rekommenderas att blint välja DNA-fragment av storlek och bara lita på DNA stege för läggning att minimera exponering av DNA-fragment för UV-ljus, kan geler färgas efteråt för kvalitetskontroll av matsmältningen och skärning. Figur 2B visar ett representativt exempel på en sida gel från vilka DNA fragment mellan 20 och 30 bp har blivit censurerade. Gel renat MNase fragment lastades på en 20% sida gel för att kontrollera framgångsrika storlek urval och rening av MNase-rötas fragment (figur 2 c). Protokollet till hands är förenlig med användningen av anpassade linker sekvenser, gör det möjligt för att klona MNase-rötas fragment i gärna uttryck vektorer av val. Här användes gärna-PLKO9 som ryggrad. Linkers förstärks från gärna uttryck vektorn med standard PCR. Figur 2D skildrar ett representativt exempel på förstärkta linker sekvenser saknar ytterligare, felaktig eller ingen mall amplikoner. Nästa, länkare amplikoner smälts med restriktionsenzym att säkerställa linkers är sammanskrivna på MNase-rötas fragment i rätt riktning. Figur 2D visar agaros gel av 5' och 3' linkers före och efter rötning med HindIII och SacII respektive anger fullständig nedbrytning av linkers till de förutspådda 637 och 295 bp. Den högra delen av bilden gel dokumenterar excision av smält linker fragment. Följande gel utvinning av smält linkers, nästa steg i protokollet är ligering av linkers till slutet reparerade MNase-rötas fragment. Eftersom linker sekvenser genereras av PCR använder unphosphorylated primers, bör själv ligering av linkers inte uppstå. Endast slutet reparerade MNase-rötas DNA fragmenten ger de nödvändiga för ligering fosfatgrupper. Efter nick översättning, ligatur produkten är förökas med PCR. För att undvika överdriven PCR-amplifiering partiskhet som kunde skeva representationen av gärna sekvenser i biblioteket, är förstärkning begränsad till mindre än 20 cykler totalt. Efter PCR är förstärkning produkter svårt att visualisera på agaros gel. Separat kontroll primärvården med 32 cykler utförs därför för att identifiera produkterna (men används inte för bibliotek förberedelse). Resultaten från denna kontroll PCR visas i figur 2E. Detta tillåter att optimera ligering reaktionerna och säkerställa reaktioner saknar PCR artefakter, som ibland förekommer i ”inga fragment kontroller” (NFC). Figur 2E visar den önskat Amplikonen (5' linker + DNA-fragment + 3' länkare, längd: 869 bp) efter amplifiering av ligering reaktioner med equimolar (1:1) förhållandet mellan fragment och länkare sekvenser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Figur 1 : Föreslog tidslinje för att förbereda ett gärna bibliotek. CORALINA erbjuder en enkel och kostnadseffektiv strategi för generering av omfattande gärna bibliotek från en uppsjö av olika DNA källor från någon organism. Protokollet till hands kan föras till färdigställande under en arbetsvecka. Linker generation kan utföras parallellt med DNA-slutet-reparation. Beredning av electrocompetent bakterier tar två dagar och inkluderar en övernattning tillväxt steg och bör därför inledas innan montering reaktioner ställs in. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Figur 2 : Kritiska moment under protokollet. (A) kontrollerade rötning av BAC DNA möjliggör generering av fragment av olika storlekar. Här visas optimering av MNase matsmältningen. Renat BAC DNA behandlades med olika mängder av MNase för 10 min. 10 U MNase generera DNA fragment av önskad längd (20-30 bp). (B) storlek urval av skärvor som är mellan 20 och 30 bp använder excision från polyakrylamidgeler. Renat BAC DNA behandlades med 10 U av MNase i 10 min. Bilden spelades efter excision. (C) kvalitetskontroll av gel-renat fragment. Efter gel-rening, 1/6th av den renade MNase fragment var lastas en 20% sida gel att kontrollera framgångsrika storlek urval och rening. (D) förstärkning av linker sekvenser för montering och restriktionsenzym rötning av linkers att säkerställa riktad kloning. 5' och 3' linkers var förstärkt och skär med HindIII och SacII, respektive. Nr-mall kontroller (NTC) ingick att kontrollera för PCR-artefakter och DNA kontaminering. Vänster: analytisk Exempelprogrammet; höger: preparativ exempelprogrammet. Bild spelades efter gel excision. (E) framgångsrika ligering av linkers till DNA-fragment kan analyseras med PCR med ett ökat antal PCR-cykler (32) och kontrolleras av utför ingen mall kontroller med H2O (NTC) eller med hjälp av NTC från föregående nick översättning steg som indata (NTC NT)). Det är viktigt att inkludera en ingen fragment kontroll (NFC), som är en förstärkning från en ligatur och nick översättning reaktion som MNase fragment utelämnades. Bara prover i vilka MNase fragment har kombinerats med linker DNA producera den förväntade kopian (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Metoder för att skapa storskaliga gärna bibliotek bör vara enkel, effektiv och kostnadseffektiv. Vi beskriver ett protokoll för produktion av gärna bibliotek baserat på enzymatisk nedbrytning av mål-DNA. Denna metod, CORALINA (omfattande gärna biblioteket generationen genom kontrollerad nuclease aktivitet) presenterar ett alternativ till kostsamma anpassade oligonukleotiden syntes.

Ett universellt protokoll för storskaliga gärna biblioteket produktion från någon DNA-källa

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekvensering: Kompletterande DNA bibliotek förberedelse protokoll använder Formalin-fast Paraffin-inbäddat RNA exemplar

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralåga ingående Genome Sequencing bibliotek förberedelse från enda Tardigrade prov

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parning-baserade överuttryck bibliotek Screening i jäst

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

En anpassningsbar protokoll för sträng församlingen gärna kloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Utvärdering av en Universal kapslad omvänd transkription polymerase kedje reaktion för detektion av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Direkt Gene knock-out av axolotl ryggmärgen neurala stamceller via elektroporation av CAS9 protein-gRNA komplex

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

En komplett pipeline för att isolera och sekvensera mikroRNAs, och analysera dem med hjälp av Open source-verktyg

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...