Name: a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

Yazarlar Prof. Dr. Stephan Beck ve Prof. Dr. Magdalena Goetz onların bilgi için teşekkürler, yardımcı ve CORALINA yöntemi, Maximilian Wiessbeck ve Valentin Baumann yararlı yorumlar için gelişmekte olan destek istiyorum. İş DFG (STR 1385/1-1) tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+profiles+to+function+in+epigenomics.">From profiles to function in epigenomics.</a> Nat Rev Genet. 18 (1), 51-66 (2017).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities.">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORALINA:+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening.">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917-940 (2016).</li><li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening.">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method.">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries.">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

CORALINA hedef DNA kontrollü nükleaz sindirim tarafından büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak ve elde edilen çift telli parçalarını klonlama toplu için kullanılabilir. İstatistiksel çıkarsama çok fazla 107 bireysel gRNA dizileri zaten başarıyla el9iletişim kuralını kullanarak klonlanmış olduğunu gösterir. CORALINA birden fazla şekilde özelleştirilebilir. Seçtiğiniz şablon DNA bir hedef bölge ve oluşturulan Kütüphane maksimal karmaşıklığı tanımlar. Bu iletişim kuralını kullanan, CORALINA kütüphaneler insandan daha önce oluşturulmuş olan ve genomik DNA fare9. Temsilcisi sonuçları burada sunulan arıtılmış BAC DNA CORALINA kitaplıktan nesil tasvir. Daha fazla özelleştirme gRNA ifade vektör ve bağlayıcı sıraları seçimi ile elde edilebilir. Biz daha önce bağlayıcı uzunlukları Gibson derleme için üç farklı çift küçük farklılıklar nedeniyle verimliliği9' test ettik.
Sindirmek toplu DNA kökenlerine nedeniyle CORALINA gRNAs protospacer değildir genellikle tam olarak 20 bp uzunluğu, ama göstermek her ikisi de bağlıdır bir ortalamaya sahip bir uzunluğu dağıtım MNase sindirim parametrelerinin yanı sıra eksizyon boyutunu yapılan sayfa jel s. şekil 2B ve C, gösterilen temsilcisi örnek parçaları ortalama uzunluğu 19 ve 27 bp arasında gösterilmektedir. Deneyim, parçaları uzunluğu sadakatle oluşturulan gRNA protospacer9tarafından korunur. Süre parçaları 20 kısa bp elde edilen gRNAs daha yüksek hedef kapalı oranı nedeniyle kaçınılmalıdır, uzun parçaları büyük olasılıkla bir sorun olduğundan beri aşağı akım uygulamalarda çok daha az gösterdi o gRNAs protospacers 45 sürece ile kan basıncı hala vardır fonksiyonel9.
CORALINA protokolü en kritik iki adımda MNase sindirilmiş parçaları ve klonlama adımları boyutu yelpazesi vardır. Çok kısa parçaları nesil (örneğin ortalamanın altında 18 bp) veya çok fazla boş gRNA ifade vektörel çizimler birleşme-render Kütüphane işe yaramaz. Böylece, MNase sindirim adım (şekil 2A) en iyi duruma getirmek, eksizyon (şekil 2B, C), izlemek için gRNA vektör omurga tam sindirim için kontrol ve protokol boyunca hiçbir parçası denetimleri de dahil olmak üzere önemlidir. Özel bakım gRNA Kütüphane gösterimi korumak için alınacak have. Kütüphane nesil bir ortak performans sorunu genel olarak plazmid verimli transfer içine bakteri amplifikasyon için var. Böylece, bol miktarda bakteri ile mükemmel yetkinlik ve bireysel elektroporasyon olaylar, çok sayıda gRNA klon yüksek bir sayı elde etmek için gerekli.
GRNA Kütüphane üretim için yeni stratejiler CRISPR tabanlı tarama yaklaşımlar sonraki on yıl boyunca tam potansiyelini hasat için gerekli olacaktır. Önceden tarama mükellef sistemleri modellemek ve CRISPR tabanlı farklı mühendislik yaklaşımlar daha büyük bir dizi yapmak için gerekli büyük ölçekli kütüphaneler, oluşturmak düşük maliyetli, basit ve özelleştirilebilir yöntemleri için önemli bir talep vardır. Bu doğru bir ilk adım CORALINA sağlamaktadır. Potansiyel kullanır manifold özellikle genleri kapsamlı kütüphaneler üretmek için, daha az yaygın model sistemleri kütüphanelerin, son derece odaklanmış kütüphaneler ve hangi farklı CRISPR proteinler (farklı PAM ile deneysel set-up cDNA elde gereksinimleri) birlikte kullanılır.
Diğer yöntemler aksine, CORALINA girişten DNA tüm olası gRNAs oluşturur. Ancak, gerekli PAM sıra eksik gRNAs kütüphanede, gRNA kitaplığı oluşturmak için CRISPR yiyen (Tablo 1) ikinci bir enzimatik yöntem ile paylaşan bir özelliği de eklenmiştir yönteminin bir dezavantajı vardır. İdeal yöntem seçimi gRNA Kütüphane üretimi planlanan tarama özellikleri üzerinde bağlıdır için deneme, özellikle doğa (genetik, düzenleyici, intergenic) ve hedef bölgenin (tek odağı, birden çok bölge, genom çapında) boyutunu. Biz CORALINA kodlamayan, çok sayıda zaman kullanarak özel bir ters görmek veya düzenleyici bölgeleridir çözümlenmesi için eksik veya güvenilmez sırası bilgi ise (egzotik model sistemleri, türleri (örneğin microbiomes) karışımları veya deneysel olarak elde giriş), farklı CRISPR endonucleases birleştirilir veya analiz doyurarak kısa ve tanımlanmış bir odağı (BACs tarafından temsilörneğin ) gerçekleştirilir.

Bakteriyel CRISPR/Cas9 sistem adaptasyonu moleküler hedefleme aracı olarak Moleküler biyolojide en son devrim neden oldu. Daha önce hiç Kromatin tanımlanmış genomik yerlerde işlemek çok kolay. CRISPR ortak uygulamalar arasında hedeflenen gen mutasyonlar1, genom mühendislik2,3, transkripsiyon harekete geçirmek ve4susturmak gen düzenleme epigenome. GRNA kütüphaneler daha az önyargılı ekranlar mümkün kılmak gibi bir belirli CRISPR sistem uygulamaları iyi okudu aday sitelere sınırlı değildir avantajdır. Bunlar olmadan herhangi bir ön deneysel bilgi genom içinde işlevsel loci keşfi kolaylaştırmak. Ancak, gRNA Kütüphane inşaat şu anda çoğunlukla oligo-nükleotit sentezi dayanır ve insan değildir gRNA kütüphaneler satın almak için sınırlı seçenekler ya da fare kaynak veya hedef bölgeleri dışında çerçeveler okuma açık. CRISPR ekranlar zaten inanılmaz güçlü5,6,7,8, kanıtlanmış ancak böylece, kendi potansiyellerini henüz istismar değil.
Üstesinden gelmek için klasik gRNA nesil yöntemleri iki stratejileri sınırlandırılması son zamanlarda geliştirilmiştir. Her ikisi de hedef DNA üzerinde özel Oligonükleotid sentez güvenerek daha kontrollü Enzimatik sindirim temel alır. İken CORALINA9 micrococcal nükleaz, sadece mevcut alternatif yöntem10CRISPR yiyen, geçici kullanma-enzimleri (HpaII, ScrFben Bfaben ve Mmeben). Önemlisi, her iki teknik gRNA protospacer dizileri kaynağı olarak hizmet veren giriş DNA var mı, uygulanabilir. CRISPR yiyen yöntemi klonlanmış gRNAs gerekli S.pyogenes PAM (protospacer bitişik güdü) hedefleme olan siteleri takip sayısını azaltmak için bir strateji iken, tüm olası fonksiyonel gRNAs için sadece küçük bir kısmını oluşturur bir belirli bölge. CORALINA, öte yandan, kaynak sırası için tüm olası gRNAs oluşturmak yapabiliyor ama aynı zamanda işlevsel olmayan kılavuzları daha yüksek bir kısmını içermektedir. gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile sağlar kapsamlı gRNA kütüphaneleri herhangi bir tür için üretim herhangi bir Cas9-protein veya - efektör sistemi basit ve maliyet-etkin bir şekilde. Ayrıca, kitaplık türü, boyutu ve içerik uygun giriş ve vektör seçenekleri tanımlamak gibi CORALINA özelleştirme için uyarlanabilir. Burada ayrıntılı bir protokol bu anlatılan bakteriyel yapay kromozomu (BACs) veya genomik DNA9dahil olmak üzere nesil DNA (şekil 1), farklı kaynaklardan gelen kapsamlı gRNA kitaplıkları için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı eşlik eden temsilcisi sonuçları BAC DNA'yı CORALINA Protokolü uygulayarak elde edilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">500 mM EGTA</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">03777-10G</td>
			<td style="width:272px;">1.4., Inactivation of Mnase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6678</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Gels, 20%, 10 well</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">EC6315BOX</td>
			<td style="width:272px;">2.1., pre-made 20 % PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">O&#39;RangeRuler 5 bp DNA Ladder,</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">SM1303</td>
			<td style="width:272px;">2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Novex&#174; TBE Running Buffer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">LC6675</td>
			<td style="width:272px;">2.1., PAGE gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Disposable scalpel, sterile</td>
			<td style="width:139px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:140px;">233-5363&#160;</td>
			<td style="width:272px;">2.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;"> 
			S9430</td>
			<td style="width:272px;">2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:229px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15593-031</td>
			<td style="width:272px;">3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycogen</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">10901393001</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">3M Sodium acetate , pH5.2</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">&#160; R1181</td>
			<td style="width:272px;">3.6.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:272px;">3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Quick blunting kit&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">E1201</td>
			<td style="width:272px;">4.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">ammomium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1542</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">magnesium acetate</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			M5661</td>
			<td style="width:272px;">3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">&#160; MOLEM37465520 (or Promega V4231)</td>
			<td style="width:272px;">2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td style="width:139px;">Beckman coulter</td>
			<td style="width:140px;">A63881</td>
			<td style="width:272px;">5.3. + 6.5.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:139px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:140px;">28704</td>
			<td style="width:272px;">5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">concentrated T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">&#160;M0202T</td>
			<td style="width:272px;">6.1.+ 8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Long Amp Taq 2X Master Mix&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0287S</td>
			<td style="width:272px;">6.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0531S</td>
			<td style="width:272px;">5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">HindIII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0104S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">SacII</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0157S</td>
			<td style="width:272px;">5.4.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">AgeI</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">R0552S</td>
			<td style="width:272px;">8.2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Tris base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">2M MgCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">93362</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">dGTP,dATP, dCTP, dTTP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">N0446S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">DTT</td>
			<td style="width:139px;">Sigam</td>
			<td style="width:140px;"> 
			DTT-RO</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">PEG-8000&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			P5413</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">NAD</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			N6522</td>
			<td style="width:272px;">8.1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0363S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Phusion DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0530S</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0208L</td>
			<td style="width:272px;">8.1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">rSAP</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:140px;">M0371S</td>
			<td style="width:272px;">8.3.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">TG1 competent cells</td>
			<td style="width:139px;">Lucigen</td>
			<td style="width:140px;">60502-1</td>
			<td style="width:272px;">9.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">1mm gap electroporation cuvettes&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">732-2267&#160;</td>
			<td style="width:272px;">10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:140px;">DIS-988-010M&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S7653&#160;</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Bacto-tryptone</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">211705</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:140px;">212750</td>
			<td style="width:272px;">9.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Agar</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			A1296</td>
			<td style="width:272px;">9.4.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:229px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;"> 
			G5516</td>
			<td style="width:272px;">9.17.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">MNAse</td>
			<td style="width:139px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>throughout</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Micropulser</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:229px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:139px;">Biorad</td>
			<td>732-2267&#160;</td>
			<td>10.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>9.1-9.9.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a universal protocol for large-scale grna library production from any dna source

Genom ve epigenome mühendisliği için CRISPR/Cas9 sistemi popülerlik onun sadelik ve adaptasyon kaynaklanıyor. Bir efektör (Cas9 nükleaz veya nükleaz ölü dCas9 füzyon proteini) tarafından Kılavuzu RNA veya gRNA olarak bilinen küçük bir sentetik RNA genomu belirli bir sitedeki hedeflenmektedir. CRISPR sistem önerebilirim doğası plazmid kitaplıkları içeren ifade kaset binlerce bireysel gRNAs tek bir deney birçok farklı sitelerdeki sorgulamak için kullanılabilir beri yaklaşımlar eleme içinde kullanımı sağlar.
Bugüne kadar gRNA dizileri kitaplıkları inşası için neredeyse sadece kütüphane serilerinde ulaşılabilir karmaşıklığı sınırlar ve görece maliyet yoğun Oligonükleotid sentezi tarafından üretilmedi. Burada, ayrıntılı bir protokol CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile), basit ve son derece karmaşık gRNA kütüphaneler nesil için düşük maliyetli yöntemi, giriş DNA Enzimatik sindirim üzerinde temel açıklanan. DNA'ın herhangi bir kaynaktan CORALINA kütüphaneleri oluşturulabilir beri pek çok seçenek özelleştirme için çok çeşitli ekranlar CRISPR tabanlı etkinleştirme mevcuttur.

El altında iletişim kuralını kullanarak, CORALINA gRNA kütüphaneler insan ve fare genomik DNA9 ve BAC DNA (şekil 1) üretilmedi. Giriş DNA gRNA ifade vektörel çizimler klonlama için uygun parçaları üretmek için kontrollü nükleaz sindirim için optimal koşullar belirlenmesi gerekir. Tipik bir sonuç micrococcal nükleaz sindirim optimizasyonu için şekil 2Atasvir edilir. Nükleaz yetersiz miktarda (0,1, 2, 3, 4, 4,5-5 birimleri) üretir (10-100 bp) gereken boyut aralığındaki göze çarpan ürün ve 5,5-7,5 birimleri hala üretilen ortalama olarak çok uzun olan parçaları. Enzim (50 adet) daha büyük miktarlarda giriş DNA aşırı düşüşü 10 dk sonra yol. Sonuç olarak, bir ara tutar (10 adet) seçildi. "Denemeler" den yeterince üretmek için parçaları sonraki arıtma ve (şekil 2B) klonlama için sindirilmiş ölçekli. Bu körü körüne DNA parçalarının boyutuna göre seçin ve sadece DNA parçalarının ışığa maruz kalma UV en aza indirmek oryantasyon DNA merdiveninde itimat için tavsiye edilir iken, jelleri sindirim ve kesme kalite kontrolü için daha sonra Boyanabilen. Şekil 2B hangi DNA parçaları arasında 20 ve 30 bp eksize bir sayfa jel temsil edici bir örnek gösterir. Jel saf MNase parçaları başarılı boyutu seçimi ve arıtma MNase sindirilmiş parçaları (şekil 2C) kontrol etmek için sayfa jel % 20 yüklü. İletişim kuralı el altında özelleştirilmiş Bağlayıcı sıraları, MNase sindirilmiş parçaları seçim gRNA ifade vektörel çizimler clone için izin kullanımı ile uyumludur. Burada, gRNA-PLKO9 bel kemiği olarak kullanıldı. Halkalı standart PCR kullanarak gRNA ifade vektör güçlendirilmiş. Şekil 2B güçlendirilmiş Bağlayıcı sıraları ek, yanlış, yoksun veya hiçbir şablon amplicons temsil edici bir örnek gösterilmektedir. Daha sonra bağlayıcı amplicons halkalı doğru yönde MNase sindirilmiş parçaları üzerine bakmaksızın emin olmak için enzimleri ile sindirmek. Şekil 2B özel jelleri 5' ve 3' halkalı, önce ve sonra sindirim HindIII ve SacII ile sırasıyla gösterir gösteren öngörülen 637 ve 295 halkalı tam sindirim kan basıncı. Jel görüntünün sağ kısmı sindirilir bağlayıcı parçaları eksizyon makaleler. Aşağıda sindirilir halkalı çıkarımı jel, halkalı MNase sindirilmiş sonunda tamir parçaları için ligasyonu protokolündeki sonraki adımdır. Bağlayıcı sıraları unphosphorylated primerler kullanılarak PCR tarafından üretmediğinden halkalı öz ligasyonu değil vuku bulmak. Sadece son tamir MNase sindirilmiş DNA parçaları fosfat grupları ligasyonu için gerekli sağlar. Nick çeviri ligasyonu ürün PCR ile güçlendirilmiş. GRNA dizileri kütüphanede gösterimi çarpık aşırı PCR güçlendirme önyargı önlemek için amplifikasyon 20'den az döngüleri toplam sınırlıdır. PCR, amplifikasyon ürünleri özel jeller üzerinde görselleştirmek zordur. Ayrı denetim PCR 32 çevrimleri ile bu nedenle ürünleri algılamak için gerçekleştirilir (ancak Kütüphane hazırlık için kullanılmaz). Bu denetim sonuçlarını PCR şekil 2Eiçinde gösterilen. Bu tüp ligasyonu reaksiyonlar optimize etmek ve reaksiyonlar bazen "hiçbir parçaları denetimlerde" oluşan PCR eserler yoksun sağlamak için sağlar (NFC). Şekil 2E istenen amplicon gösterir (5' bağlayıcı + DNA parçası + 3' bağlayıcı, uzunluk: 869 bp) amplifikasyon ligasyonu reaksiyonların ekimolar (1:1) oranları parçaları ve bağlayıcı sıraları arasında kullanarak takip.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Resim 1 : GRNA kitaplığı hazırlanması için zaman çizelgesi önerdi. CORALINA basit ve maliyet-etkin bir strateji kapsamlı gRNA kitaplıkları oluşturmak için farklı DNA kaynaklardan herhangi bir organizma bir bolluk sunmaktadır. İletişim kuralı el altında tamamlanması sırasında iş günü getirilebilir. Bağlayıcı üretimi, DNA sonu-tamiri ile paralel olarak gerçekleştirilebilir. Electrocompetent bakteri hazırlanması iki gün sürer ve bir gecede büyüme adım içerir ve bu nedenle reaksiyonlar ayarlanır derleme önce başlatılmalıdır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Resim 2 : Protokol sırasında kritik adımlar. (A)kontrollü sindirim BAC DNA parçaları farklı boyutlarda nesil sağlar. Burada gösterilen MNase sindirim optimizasyonu olduğunu. 10 dk. 10 U MNase oluşturmak için DNA parçalarının İstenilen uzunlukta (20-30 bp) saf BAC DNA MNase farklı miktarda ile tedavi edildi. (B) boyutu parçaları eksizyon üzerinden polyacrylamide Jeller kullanarak 20 ve 30 bp arasında seçim. Arıtılmış BAC DNA 10 U MNase 10 dk ile tedavi edildi. Görüntü eksizyonu kaydedildi. (C) kalite kontrol, jel saf parçacıkları. Jel-arıtma sonra 1/6th saf MNase parçaları yüklü olduğunu %20 başarılı boyutu seçimi ve arıtma denetlemek için sayfa jel. (D) amplifikasyon halkalı yönlü klonlama emin olmak için derleme ve restriksiyon enzimi hazım için bağlayıcı sıraları. 5' ve 3' halkalı güçlendirilmiş ve HindIII ve SacII, sırasıyla kesti. Hayır-şablonu denetimler (NTC) PCR eserler ve DNA kirlenme için denetime dahil edildi. Sol: analitik örnek uygulama; doğru: partiye hazırlık örnek uygulama. Görüntü Jel kesme sonra kaydedildi. Halkalı DNA parçaları için (E) başarılı ligasyonu PCR artan sayıda PCR döngüsü (32) ile kullanarak ve hiçbir şablon kontrolleri ile H2O (NTC) gerçekleştirme veya önceki nick çeviri adımdaki NTC kullanarak kontrol analiz edilebilir giriş olarak (NTC NT)). Bir amplifikasyon ligasyonu ve nick çeviri tepki içinden MNase parçaları ihmal olan bir parça kontrol (NFC), eklemek önemlidir. Beklenen amplicon hangi MNase Birleşik parçalar bağlayıcı ile DNA örnekleri üretmek sadece (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source at JoVE.com

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Büyük ölçekli gRNA kitaplıkları oluşturmak için yöntemleri basit, verimli ve maliyet-etkin olmalıdır. Biz gRNA kütüphaneler hedef DNA Enzimatik sindirim üzerinde dayalı üretim için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem CORALINA (kapsamlı gRNA Kütüphane üretimi kontrollü nükleaz faaliyetleri ile) pahalı özel Oligonükleotid sentezi için bir alternatif sunuyor.

Büyük ölçekli gRNA Kütüphane üretim herhangi bir DNA kaynaktan için evrensel bir iletişim kuralı

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

CAS9 protein-gRNA kompleksleri Electroporation yoluyla Axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen Knock-Out

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...