Name: application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

الكتاب يود أن يشكر الدكتور صمويل حاء ويلسون في "الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية" لخطوط الخلايا المستخدمة في هذا العمل.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

استخدام الشروط الموضحة هنا، أي مجهر [كنفوكل] مع الأشعة فوق البنفسجية-أ أو 405 نانومتر الليزر، أما المتكاملة حسب الشركة المصنعة أو إضافتها بواسطة المستخدم النهائي، يمكن أن تحفز تلف الحمض النووي داخل نواة الخلية والسماح بتجنيد البروتينات إصلاح الحمض النووي إلى موقع الناجم عن تلف الحمض النووي التي يتعين رصدها. ومع ذلك، كما ذكر في البروتوكول والنتائج التمثيلية، واختيار الطول الموجي، تطبق السلطة، وتوصيف الأضرار جميعها بأهمية المسائل التي يجب معالجتها أولاً قبل المستخدم من أجل دراسة الحمض النووي خاصة إصلاح الطريق. بالإضافة إلى ذلك، هناك اعتبارات أخرى في تصميم التجارب التي يجب أن تنظر أيضا إلى المستخدمين.
بغية مراقبة السلوك للبروتين في وظيفة الخلايا الحية الدقيقة-التشعيع، بروتين مسمى فلوريسسينتلي يجب إنشاء. توفر مجموعة واسعة من البروتينات الفلورية التي يمكن فصلها طيفيا يوفر أدوات لخلق اندماج البروتين التي يمكن استخدامها لوصف الاستجابات الخلوية لاستحثاث تلف الحمض النووي. تعداء عابرة من البروتينات الفلورية ذات الاهتمام يسمح للفحص السريع لظروف ضارة، والطفرات، أو حتى مثبطات، بينما تقدم ستابلي transfected الخلايا المزيد من السيطرة على مستويات التعبير والسماح للكيمياء الحيوية الأخرى الأوصاف التي يمكن القيام بها، التحقق من صحة النتائج الدقيقة-التشعيع. يمكن أيضا الاستفادة من البروتينات الفلورية طيفيا متميزة في نفس الخلية لرصد التفاعلات بين البروتينات داخل المسار نفسه، أو في مسارات مختلفة. البروتينات الفلورية أيضا القضاء على الحاجة إلى أجسام مضادة محددة لكل البروتين من الفائدة والسماح بخلية حية رصد السلوك البروتين لفترات طويلة من الزمن بعد التعريفي للضرر.
ومع ذلك، قد استخدام البروتينات الفلورية أيضا عيوب. دون الخلفيات الوراثية ناقصة في protein(s) للفائدة، سوف تتنافس البروتينات الذاتية مع البروتينات المعلمة فلوريسسينتلي. تصريف علامة مضيئة للمحطة N أو ج من البروتين قد يغير طي البروتين، ويعوق تفاعلات البروتين البروتين الرئيسية، أو منع إشارات إزفاء؛ تغيير الدالة ويحتمل أن تؤثر على ديناميات التوظيف. أثبتت هذه الآثار في عدد من التقارير تلطيخ إيممونوفلوريسسينت أثبت فيها توظيف مختلفة إلى حد كبير ومرات الاحتفاظ للبروتينات الذاتية في موقع الضرر28. استخدام تعداء عابرة أو استنساخ مستقرة أيضا تغيير الاستجابة لاحظ، عادة من خلال التغيرات في مستويات التعبير البروتين. علاوة على ذلك، استخدام البروتينات الفلورية متعددة في تجربة واحدة قد تغير أيضا القوى المحركة للتوظيف، إذا لم يتم اكويليبراتيد مستويات البروتين جيد أو إذا كان توظيف البروتين فلوريسسينتلي معلم أكبر يمنع تجنيد البروتينات الأخرى . وأخيراً، يمكن أن تعمل البروتينات الفلورية كعوامل التوعية ضعيفة، وتزايد تشكيل الأنواع الأكسجين التفاعلية، واحتمال تغيير الحمض النووي الضرر الخلائط المستحث46،47. وعلى الرغم من هذه العيوب، توفر البروتينات الفلورية إصلاح عدد من مزايا واضحة في دراسة الحمض النووي مع التشعيع الصغرى، وإذا كان المستخدمين إدراج عناصر التحكم المناسبة، مثل وصف الضرر الموصوف هنا، أنها يمكن أن تقدم نظرة جديدة إلى تلف التفاعلات استجابة والبروتين-بروتين3.
إذا كان غير مطلوب تصوير الخلايا الحية، يمكن استخدام الفلورة لرصد الاستجابة للأضرار العمدي. عن طريق تحديد الخلايا في أوقات محددة بعد التعريفي الأضرار وتلطيخ مع الأجسام المضادة المحددة للبروتينات وآفات الفائدة، ولقطات ثابتة من الضرر التعريفي والتوظيف والاحتفاظ بإصلاح يمكن أن يبني البروتينات. يمكن استخدام الأجسام المضادة لرصد تجنيد البروتينات متعددة الفوائد و/أو التعديلات بوستترانسلاشونال الناجمة عن الاستجابة تلف الحمض النووي. استخدام الفلورة يلغي الحاجة للبروتينات الفلورية، ويسمح للسلوك البروتين الذاتية لفحصها. ومع ذلك، هذا الأسلوب أيضا عيوبها. ضرورية أجسام مضادة محددة للغاية، وبيرميبيليزيشن وإجراءات حظر بحاجة إلى أن يكون الأمثل للسماح للكشف عن التوظيف بكثافة إشارة كافية. تحديد إجراءات ليست لحظية، ويحد هذا القيد المادي القرار الزماني لهذا النهج. تعيين موقع التعريفي الضرر حتى يمكن أن تكون الخلايا إعادة يقع بعد تلطيخ يمكن أيضا تحديات كبيرة. المجهر [كنفوكل] المستخدمة في هذا العمل يسمح للتسجيل المستندة إلى الصور كما هو موضح أعلاه، حيث يمكن نقل الخلايا التالفة بدقة عالية. إذا كانت مرحلة التسجيل أو محفوراً كوفيرجلاس غير متوفرة، وقت الاستثمار تشارك في نقل الخلايا دون تسجيل المرحلة، مقترنة بالتأخير المتأصلة بين الضرر التعريفي وتجنيد المصورة، قد جعل الفلورة غير جذابة لبعض المستخدمين. ومع ذلك، سيتضمن التصاميم التجريبية الصغيرة-التشعيع الأكثر دقة واكتمال هذه الأنواع من نهج بالتوازي مع استخدام البروتينات الفلورية، كما هو موضح في البروتوكول المقدم.
هنا، يستخدم تصوير الخلايا الحية والفلوره لإثبات جدوى الليزر الجزئي-التشعيع. تلوين إيممونوفلوريسسينت يسمح لنا ببحث دقيق خليط تلف الحمض النووي التي تم إنشاؤها وتجنيد البروتينات التي يتسبب فيها بكل قوة الليزر، التي تسمح لنا بشكل أفضل تفسير التعديلات الملحوظة في التوظيف والاحتفاظ XRCC1-التجارة والنقل. وبناء على هذه النتائج، ينبغي استخدام 405 نانومتر الليزر المحدودة لدراسة البروتينات البر وسبر. علاوة على ذلك، أفضل تصميم تجريبية تشمل قياسات الطاقة بعد الهدف، وتوصيف خليط الضرر الكامل لكل خط الخلية المستخدمة، والتحقق من التوظيف واستبقاء الملاحظ في فلوريسسينتلي معلم البروتينات مع الفلورة. ومن الواضح أن المعدات والوقت، واعتبارات التكلفة قد يجعل هذه التصاميم التجريبية الأمثل المستحيل لبعض المستخدمين. بيد أن أهمية كل عنصر من هذه العناصر تتجلى هنا والمستخدمين يجب أن نأخذ هذه الاعتبارات في الاعتبار عندما تبدأ التجارب الصغرى-التشعيع.

مجهر فلوري برز كتقنية قوية لتصور البنية الخلوية ودراسة التعريب البروتين، ورصد تفاعلات البروتين البروتين والبروتين-الحمض النووي. استخدام مجهر فلوري لدراسة الردود تلف الحمض النووي بعد تطبيق الحمض النووي العالمي إتلاف عوامل، مثل الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء، الإشعاعات المؤينة، والأكسدة الكيميائية أو وكلاء alkylating، و/أو تشريعات وفرت ثاقبة جديدة بدء، إشارات، والتجنيد للحمض النووي إصلاح البروتينات إلى مواقع الحمض النووي الضرر1،2. ومع ذلك، تحد هذه العالمية والأضرار بأحداث متزامنة إذا معلومات مفصلة حول أمر التعيين، حركية الارتباط أو الانفصال، ويجري البحث عن العلاقات بين البروتينات إصلاح الحمض النووي الرئيسية. لحسن الحظ، التقدم في ليزر المسح مجاهر [كنفوكل]، توفر أوسع نطاقا من موجات الليزر يحفز الضرر، والتحسينات في البروتينات الفلورية على مدى السنوات ال 25 الماضية قدمت الباحثين مع أدوات محسنة لدراسة هذه إصلاح جوانب من الحمض النووي، عن طريق الاستقراء أضرار الحمض النووي المستهدف.
تشعيع الخلايا التي تحتوي على microbeams الليزر من أجل دراسة وظائف الخلايا وسوبسيلولار أداة راسخة في بيولوجيا الإشعاع والخلية3. تطبيق هذه التقنية لدراسة إصلاح الحمض النووي ظهرت عند استخدام الأشعة فوق البنفسجية درجة عالية من التركيز كريمر وزملاء العمل (257 nm) نظام ميكروبيام الليزر للحث على أضرار الحمض النووي أكثر 0.5 ميكرومتر بقعة في الهامستر الصيني المبيض (شو) خلايا4 والمنشأة تحريض الحمض النووي فوتوليسيونس بهذا النظام5. في حين تقدم تحسينات كبيرة على أساليب ميكروبيم الأشعة فوق البنفسجية في الوقت، اعتماد هذا إتلاف النظام كانت محدودة بسبب إعداد متخصصة، وقدرتها على توليد فواصل حبلا مزدوجة (دسبس)6. التحقيق اللاحق لمجموعة متنوعة من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية-باء (290-320 nm)-كشف الأطوال موجية (320-400 نانومتر) بعدد من المجموعات أن الأشعة فوق البنفسجية برومة، عنصر مؤكسد قاعدة الآفات، فواصل جديلة واحدة (SSBs)، ويمكن أن يتسبب دسبس تعتمد على الطول الموجي الليزر و تطبق السلطة4،،من78،9،10 (إعادة النظر في 3). علاوة على ذلك، تركيبات من هذه الأشعة فوق البنفسجية-باء وأطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية-أ مع توعية وكلاء، مثل سورالين، بروموديوكسيوريديني (بردو)، والأصباغ هويشت، عثر أيضا للحث على أضرار الحمض النووي يعتمد على الطول الموجي، والطاقة، ومدة التعرض، على الرغم من أن السلطة بحاجة إلى حمل غالباً ما يخفض الضرر حضور هذه العوامل12،11،13،،من1415. هذه التطورات بتوسيع نطاق استخدام مايكرو-التشعيع، على الرغم من وجود عقبات فنية لا يزال يتعين معالجتها للتوسع في اعتماد هذه الأساليب.
كريمر وزملاء العمل دفعة قوية لمجال تشعيع الصغرى بالتحديد التركيز ميكروبيم الأشعة فوق البنفسجية لتطبيق الطاقة ضررا كبيرا على منطقة عالية مترجمة في الخلية. كما نظم الليزر ميكروديسيكشن ومجاهر [كنفوكل] متقدمة, الضوء تركيزاً كان موجوداً على نطاق أوسع؛ ومع ذلك، أن اقتران مصادر الأشعة فوق البنفسجية إلى نطاقات والتعامل مع الانحرافات اللونية التي يتسبب فيها أنها لا تزال تحديات كبيرة لمعظم المستخدمين3،،من616. صبغات الأشعة فوق البنفسجية زادت شعبية طوال عقد التسعينات، البصريات قادرة على التركيز والالتقاط fluorescence متحمس الأشعة فوق البنفسجية وأصبحت متاحة على نطاق واسع16، والتحسينات في ليزر المسح عرض المستخدمين القدرة على إنشاء عالية تركز الأشعة فوق البنفسجية البقع الإثارة داخل الخلايا6،17. ومع ذلك، لم يكن حتى أوائل 2000s أن التأثير الحقيقي لهذا المزيج من عوارض تركيزاً مع أعلى كثافة الليزر شعر، عندما ظهرت تقارير عديدة تثبت أن فواصل حبلا الحمض النووي يمكن أن يتسبب مع أو بدون محسسات في نطاق الأشعة فوق البنفسجية-أ6،10،18،،من1920، 405 نانومتر21،،من2223،24، 26من 25،، وحتى في فترة أطول موجات مرئية مثل 488 نانومتر27. هذه التطورات التي تسمح باعتماد تقنية التشعيع الصغرى في عدد من النظم التجارية أكثر انتشارا. وبالتوازي مع هذه التطورات، ظهرت تقنيات اثنين-فوتون أيضا السماح للاستقراء الدقيق من تلف الحمض النووي؛ على الرغم من أن هذه التطورات لن تناقش هنا، هناك عدد من المقالات الاستعراض مناقشة هذه المنهجيات9،28،،من2930.
مع إمكانية الوصول إلى الحالي مجاهر [كنفوكل] القادرة على ضوء الأشعة فوق البنفسجية شديدة التركيز وتوافر البروتينات الفلورية للسماح بتتبع في الوقت الحقيقي من البروتينات إصلاح الحمض النووي على نطاق واسع، قد تطورت تقنيات التشعيع الصغرى أدوات قوية لدراسة مسارات استجابة وإصلاح أضرار الحمض النووي. ومع ذلك، يحتاج المستخدمون إلى يجب أن تدرك أن تعتمد اعتماداً كبيرا على طول موجه الليزر والطاقة المطبقة على المنطقة النووية دون توليد ضرر الحمض النووي. استخدام الأشعة فوق البنفسجية-ج (~ 260 nm) أطوال موجية تسمح مباشرة الحمض النووي الإثارة وانتقائية عالية لاستحثاث الأشعة فوق البنفسجية برومة7،8. الأشعة فوق البنفسجية-باء وأطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية-أ إنتاج مخاليط تلف الحمض النووي (الآفة الأساسية و SSBs دسبس)، التي تعتمد على قوة التطبيقية والخلفية الخلوية تستخدم7. الضيائية الذاتية ومستويات مضادات الأكسدة في الخلايا المستهدفة يمكن أن تؤثر الخلائط تلف الحمض النووي التي تنتجها هذه الأطوال الموجية. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الضيائية خارجية (بردو، إلخ) يمكن أن تساعد في خفض الطاقة اللازمة لاستحثاث تلف الحمض النووي. ومع ذلك، هذه العوامل يمكن حمل الحمض النووي الضرر بأنفسهم، وأنهم قد يغير دورة الخلية وهيكل الكروماتين، حيث أن استخدامها قد تحدث آثاراً غير مرغوب فيها التي يتعين النظر فيها من قبل المستخدم. ولذلك، قبل استخدام التشعيع الجزئي لدراسة استجابة ضرر الحمض النووي، وإصلاح، النظر بعناية في مسار إصلاح الحمض النووي للفائدة وأطوال موجية متوفرة للاستخدام، والخليط تلف الحمض النووي التي تم إنشاؤها مطلوب.
هنا، يتم إجراء الليزر الجزئي-التشعيع عند أطوال موجية استخداماً اثنين، 355 نانومتر و 405 نانومتر، دون محسسات لإثبات الخلائط الحمض النووي الضرر الناجم عن هذه الأطوال الموجية وتأثيرات هذه المخاليط الضرر يكون على دراسة الإصلاحSSBs ودسبس. المستخدمين يجب أن تدرك أن هذه الأطوال الموجية لا تقم بإنشاء نوع واحد من فواصل حبلا أو الآفات الأساسية. كي تميز بين مسارات إصلاح الحمض النووي، المستخدمين يجب بعناية سيطرة القوة المطبقة على منطقة محددة من النواة وتوصيف الأضرار العمدي باستخدام عدة علامات فاصل حبلا والأجسام المضادة للآفة الحمض النووي. إذا أحسن تطبيقها وتتميز، يمكن أن تثري الليزر الجزئي-تشعيع بعض الأنواع من ضرر الحمض النووي، مما يسمح للمستخدمين لتقييم إصلاح قاعدة الآفات و SSBs أو دسبس، مع بعض الخصوصية. ولذلك، فقد وفرنا أسلوب يسمح للمستخدمين بإجراء الليزر الجزئي-التشعيع تكاثر وتوصيف الخلائط تلف الحمض النووي الناجم عن جرعة الليزر التطبيقية، والقيام بتحليل البيانات.

<table style="border-collapse:collapse;width:548pt" width="730">
	<colgroup>
		<col style="width:220pt" width="293" />
		<col style="width:119pt" width="158" />
		<col style="width:84pt" width="112" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">NIS Elements software</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">355 nm laser</td>
			<td class="xl23">PicoQuant VisUV</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Galvanometer photoactivation miniscanner</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Bruker</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Microscope slide photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S170C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fiber photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S150C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Digital handheld optical power and energy meter</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">PM100D</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">CHO-K1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158"></td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Minimal essential media</td>
			<td class="xl28">Hyclone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">SH3026501</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fetal bovine serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Atlanta biologicals</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S11550</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">XRCC1-GFP</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Origene</td>
			<td class="xl27">RG204952</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Jetprime</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Polyplus transfection</td>
			<td class="xl27">11407</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Geneticin</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl27">10131035</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155382</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">8 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155409</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 53BP-1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Novus</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">NB100304</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti-phospho-histone H2AX&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Millipore</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">05-636-I</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti cyclobutane pyrimidine dimer</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Cosmo Bio clone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">CAC-NM-DND-001</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 8-oxo-2&#180;-deoxyguanosine&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Trevigen</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">4354-MC-050</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 488 goat anti-mouse</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11029</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 546 goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11010</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">R37606</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Phosphate buffered saline</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">0780</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Normal goat serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">31873</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Jackson Immuno Research</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">001-000-162</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">37% Formaldehyde</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">9311</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Ethanol</td>
			<td class="xl20">Decon Labs</td>
			<td class="xl20">2716</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Methanol</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">VWR</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">BDH1135</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">HCl</td>
			<td class="xl20">Fisher</td>
			<td class="xl20">SA49</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Sodium azide</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:84pt" width="112">S2002</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Tris Hydrochloride</td>
			<td class="xl20">Amresco</td>
			<td class="xl20">O234</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Triton X-100</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">T8787</td>
			<td class="xl29"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells

وتوجد مسارات إصلاح الحمض النووي درجة عالية من التنسيق لكشف والمكوس واستبدال التالف قواعد الحمض النووي، وتنسيق إصلاح فواصل حبلا الحمض النووي. بينما يكون توضيح تقنيات البيولوجيا الجزيئية هيكل ووظائف الانزيمية والحركية لإصلاح البروتينات، لا تزال هناك حاجة لفهم كيف يتم إصلاح منسقة داخل النواة. الليزر الجزئي-التشعيع يوفر أداة قوية لإحداث أضرار الحمض النووي ورصد تجنيد إصلاح البروتينات. تحريض تلف الحمض النووي بالليزر الجزئي-التشعيع يمكن أن تحدث مع مجموعة من الأطوال الموجية، وموثوق بها يمكن أن يستحث المستخدمين فواصل جديلة واحدة وآفات قاعدة مزدوجة حبلا فواصل مع طائفة من جرعات. هنا، يستخدم الليزر الجزئي-التشعيع لدراسة إصلاح واحد وضعف حبلا فواصل الناجمة عن موجات ليزر [كنفوكل] المشتركة اثنين، 355 نانومتر و 405 نانومتر. ويرد توصيف المزيد والسليم من جرعة الليزر التطبيقية لحفز الخلائط أضرار محددة، حيث يمكن للمستخدمين تنفيذ تكاثر الحصول على البيانات الدقيقة-التشعيع الليزر والتحليل.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

تطبيق الليزر الجزئي-التشعيع لدراسة واحدة ومزدوجة حبلا كسر إصلاح في خلايا الثدييات

الأسفار [كنفوكل] مجهرية والليزر أدوات العرض الجزئي-التشعيع لإحداث ضرر الحمض النووي، ورصد الاستجابة للبروتينات إصلاح الحمض النووي في المجالات النووية الفرعي المحدد. هذا الأسلوب قد دفعة قوية لمعرفتنا بالكشف عن الأضرار، والإشارات، والتوظيف. هذه المخطوطة يوضح هذه التكنولوجيات لدراسة إصلاح كسر حبلا مفردة ومزدوجة.

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

عد البروتينات في الخلايا المفردة مع الحبرية عنونة [ميكروارس]

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

تطبيق 1٪ الميثيلين الأزرق صبغ كتقنية واحدة في سرطان الثدي العينة الحارس خزعة

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

فحص مراسل لتحليل نضج الحمض النووي الريبي الميكروي الإنتروني في خلايا الثدييات

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

نمذجة ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الشريان السباتي الداخلي للخلايا السرطانية

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في الفئران يلخص سرطان القولون والمستقيم المتقدم

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

تصور بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض عن طريق فحوصات التألق المناعي

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

تطبيق AlDeSense لتقسيم خلايا سرطان المبيض إلى طبقات على أساس نشاط ألدهيد ديهيدروجينيز 1A1

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...