Name: application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Samuel H. Wilson på National Institute of miljømæssige sundhed Sciences for cellelinjer bruges i dette arbejde.

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Bruger betingelserne beskrevet her, kan enhver Konfokal mikroskop med en UV-A eller 405 nm laser, enten integreret af fabrikanten eller tilføjet af slutbrugeren, fremkalde DNA skader inden for kernen i en celle og tillade ansættelse af DNA reparation proteiner til stedet for induceret DNA skader kan overvåges. Men, som anført i protokollen og repræsentative resultater, bølgelængde udvælgelse, anvendes magt, og skader karakterisering er alle vigtige spørgsmål, som skal behandles først af brugeren for at studere en bestemt DNA reparation pathway. Derudover er der andre overvejelser i eksperimentelle design, der skal også tages i betragtning af brugere.
For at overvåge en protein adfærd i levende celler post mikro-bestråling, en fluorescently mærket protein skal oprettes. Tilgængeligheden af en bred vifte af fluorescerende proteiner, der kan adskilles spektralt tilbyder værktøjer til at skabe protein fusioner, der kan anvendes til karakterisering af cellulære svar til induktion af DNA-skader. Forbigående Transfektion af fluorescerende proteiner af interesse giver mulighed for hurtig screening af skadelige betingelser, mutationer eller endda hæmmere, mens stabilt transfekteret celler giver mere kontrol over udtryk niveauer og giver mulighed for andre biokemiske beskrivelser skal udføres, validering af mikro-bestråling resultater. Spektralt forskellige fluorescerende proteiner kan også udnyttes i den samme celle til at overvåge interaktioner mellem proteiner inden for den samme sti eller i forskellige veje. Fluorescerende proteiner også fjerne behovet for specifikke antistoffer for hvert protein af interesse og give mulighed for levende celle overvågning af protein opførsel i lang tid efter induktion af skader.
Brug af fluorescerende proteiner har dog også ulemper. Uden genetiske baggrunde mangelfuld i de(n) af interesse, vil endogene proteiner konkurrere med fluorescently mærket proteiner. Konjugation af fluorescerende tag til N eller C endestation for proteinet kan ændre proteinfoldning, hindre vigtige protein-protein interaktioner eller blokere translokation signaler; ændre funktion og potentielt påvirker rekruttering dynamics. Disse virkninger er blevet påvist i en række rapporter hvor immunfluorescent farvning demonstreret dramatisk anderledes rekruttering og retentionstiderne for endogene proteiner på skade site28. Brug af forbigående Transfektion eller stabil kloner kan også ændre svar observeret, typisk gennem variationer i protein udtryk niveauer. Yderligere, brugen af flere fluorescerende proteiner i en enkelt eksperiment kan også ændre dynamikken i rekruttering, hvis protein niveauer ikke er ekvilibreres godt eller ansættelse af de større fluorescently markeret protein blokerer ansættelse af andre proteiner . Endelig, fluorescerende proteiner kan fungere som svage sensibilisering agenter, øge dannelsen af reaktive ilt arter, og potentielt ændre DNA skader blandinger induceret46,47. Trods disse ulemper tilbyder fluorescerende proteiner en række forskellige fordele i at studere DNA reparation med mikro-bestråling, og hvis brugerne indarbejde hensigtsmæssige kontrolforanstaltninger, som skader karakterisering beskrevet her, de kan give ny indsigt i skader svar og protein-protein interaktioner3.
Hvis der ikke kræves levende celle imaging, kan immunofluorescens bruges til at overvåge svar til induceret skade. Ved fastsættelse af celler på bestemte tidspunkter efter skader induktion og farvning med antistoffer specifikke for proteiner og læsioner af interesse, statisk snapshots af skader induktion og rekruttering og fastholdelse af reparation proteiner kan bygges. Antistoffer kan bruges til at overvåge ansættelse af flere proteiner af renter og posttranslationelle modifikationer induceret af DNA skade svar. Brug af immunofluorescens eliminerer behovet for fluorescerende proteiner, og giver mulighed for endogene protein adfærd undersøges. Denne metode har imidlertid også sine ulemper. Meget specifikke antistoffer er nødvendige, og permeabilization og blokerende procedurer skal optimeres for at muliggøre påvisning af ansættelse med tilstrækkeligt signal intensitet. Fastsættelse af procedurer er ikke øjeblikkelig, og denne fysiske begrænsning begrænser den tidsmæssige opløsning af denne fremgangsmåde. Kortlægning stedet for skader induktion, så cellerne kan findes igen efter farvning kan også præsentere væsentlige udfordringer. Konfokal mikroskop bruges i dette arbejde giver mulighed for image-baseret registrering som beskrevet ovenfor, så beskadigede celler kan flyttes med høj præcision. Hvis scenen registrering eller ætset daekglas ikke er tilgængelig, den tid investeringer involveret i kan bufferzonen celler uden fase registrering, kombineret med den iboende forsinkelse mellem skader induktion og afbildet ansættelse, gøre immunfluorescens uattraktive for nogle brugere. Dog vil de mest nøjagtige og fuldstændige mikro-bestråling eksperimentelle design indarbejde disse typer af tilgange parallelt med brug af fluorescerende proteiner, som beskrevet i den præsenterede protokol.
Her, bruges både levende celle imaging og immunfluorescens til at påvise nytten af laser mikro-bestråling. Immunfluorescent farvning gør det muligt for os præcist undersøge blanding af DNA skade lavet og ansættelse af proteiner induceret af hver laser power, som giver os mulighed for bedre at kunne fortolke de observerede ændringer i rekruttering og fastholdelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis. Baseret på disse resultater, bør brugen af 405 nm lasere være begrænset til undersøgelse af BER og SSBR proteiner. Yderligere, den optimale eksperimentelle design ville omfatte magt målinger efter målet, en fuld skader blanding karakteristika for hver cellelinje bruges og validering af rekruttering og fastholdelse observeret i fluorescently mærkede proteiner med immunfluorescens. Selvfølgelig, udstyr, tid og omkostninger overvejelser kan umuliggøre disse optimale eksperimentelle design for nogle brugere. Men betydningen af hvert af disse elementer er vist her, og brugere bør holde disse overvejelser i tankerne ved starten af mikro-bestråling eksperimenter.

Fluorescerende mikroskopi er opstået som en kraftfuld teknik til at visualisere cellulære arkitektur, undersøge protein lokalisering og overvågning af protein-protein og protein-DNA interaktioner. Brug af fluorescerende mikroskopi til at studere DNA skader svar efter anvendelsen af globale DNA skadelige agenser, såsom ultraviolet (UV) lys, har ioniserende stråling, kemiske oxidationsmidler eller alkylerende stoffer, og/eller kemoterapeutika givet ny indsigt i indledning, signalering og rekruttering af DNA reparere proteiner til websteder af DNA skade1,2. Men disse globale og asynkron ødelæggende begivenheder er begrænsende, hvis detaljerede oplysninger om rekruttering ordre, kinetik af association og dissociation, og relationer mellem centrale DNA reparation proteiner er søgt. Heldigvis har fremskridt i laser scanning Konfokal mikroskoper, bredere tilgængelighed af skader-inducerende laser bølgelængder, og forbedringer i fluorescerende proteiner i de sidste 25 år har givet forskere med forbedrede værktøjer til at undersøge disse aspekter af DNA reparation, gennem målrettede DNA skader induktion.
Bestråling af celler med laser microbeams for at studere cellulært og subcellulært funktioner er et veletableret redskab i celle og stråling biologi3. Anvendelse af denne teknik til undersøgelse af DNA reparation fremgik når Cremer og kollegaer brugt en meget fokuseret UV (257 nm) laser microbeam system til at fremkalde DNA-skader over en 0,5 µm spot i kinesisk hamster ovarie (CHO) celler4 og etableret induktion af DNA photolesions ved dette system5. Mens tilbyder betydelige forbedringer over UV microbeam metoder på tidspunktet, vedtagelsen af denne skadelige system var begrænset på grund af dens specialiseret sæt op, og dens evne til at generere bryder dobbeltstrenget (DSBs)6. Efterfølgende undersøgelse af en række UV-B (290-320 nm) og UV-en (320-400 nm) bølgelængder af en række grupper afslørede at UV photoproducts, oxidativ basere læsioner, enkelt streng bryder (SSBs), og DSBs kunne være fremkaldt afhængig af laser bølgelængde og magten anvendes4,7,8,9,10 (revideret i 3). Yderligere, kombinationer af disse UV-B og UV-A bølgelængder med sensibiliserende stoffer, som psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) og Hoechst farvestoffer, blev også konstateret for at inducere DNA skader afhængig af bølgelængde, magt og varigheden af eksponering, selvom strømmen skulle fremkalde skader er ofte sænket i nærværelse af disse agenter11,12,13,14,15. Disse fremskridt udvides brugen af mikro-bestråling, men der var stadig tekniske forhindringer skal behandles for bredere anvendelse af disse metoder.
Cremer og kollegaer betydeligt avancerede inden for mikro-bestråling ved netop at fokusere UV microbeam for at anvende betydelige skadelige energi over et stærkt lokaliseret område i cellen. Som Konfokal mikroskoper og laser microdissection systems avancerede, blev stramt fokuseret lys mere bredt tilgængelige; dog præsenterede kobling UV kilder til anvendelsesområder og beskæftiger sig med den kromatiske aberration de induceret stadig betydelige udfordringer til de fleste brugere3,6,16. Som UV farvestoffer steget i popularitet i hele 1990 ' erne, optik i stand til at fokusere og fanger UV-spændt fluorescens blev mere bredt tilgængelige16og forbedringer i laser scanning tilbydes brugerne fokuseret mulighed for at skabe meget UV excitation steder inden for celler6,17. Men det var ikke indtil de tidlige 2000 'er at den reelle virkning af denne kombination af stramt fokuseret bjælker med højere intensitet lasere mente, når talrige rapporter opstået demonstrerer, at DNA strand pauser kan induceres med og uden sensibiliserende i den UV-A range6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, og selv ved længere synlige bølgelængder som 488 nm27. Disse fremskridt er tilladt for mere udbredt anvendelse af mikro-bestråling teknik på en række kommercielle systemer. Parallelt med denne udvikling opstod to-foton teknikker også der tillod præcis induktion af DNA skade; Selvom disse fremskridt ikke vil blive diskuteret her, er der en række review artikler diskuterer disse metoder9,28,29,30.
Med den aktuelle tilgængelighed af Konfokal mikroskoper kan levere meget fokuseret UV-lys og udbredt tilgængelighed af fluorescerende proteiner til at tillade sporing af DNA reparation proteiner i realtid, mikro-bestråling teknikker har udviklet sig til kraftfulde værktøjer til at undersøge DNA skader svar og reparation veje. Men brugerne skal være klar over, at generation af DNA-skader er meget afhængige af laser bølgelængde og kraften påføres de sub atomare område. Brug af UV-C (~ 260 nm) bølgelængder giver mulighed for direkte DNA excitation og høj selektivitet for induktion af UV photoproducts7,8. UV-B og UV-A bølgelængder producerer blandinger af DNA-skader (base læsion, SSBs og DSBs), afhængig af den anvendte kraft og cellulære baggrunden udnyttet7. Endogene photosensitizers og anti-oxidant niveauet i de målrettede celler kan påvirke DNA skader blandinger fremstillet af disse bølgelængder. Derudover kan brug af eksogene photosensitizers (BrdU, etc.) hjælpe til at sænke den energi, der kræves til induktion af DNA-skader. Men disse agenser kan fremkalde DNA-skader sig selv, og de kan ændre cellecyklus og kromatin struktur, så deres anvendelse kan producere uønskede virkninger, der skal overvejes af brugeren. Derfor, før du bruger mikro-bestråling for at studere DNA skader svar og reparation, nøje overvejelse af DNA reparation pathway, de bølgelængder, der er tilgængelige til brug, og DNA skader blanding lavet er påkrævet.
Her, laser mikro-bestråling er udført på to almindeligt anvendte bølgelængder, 355 nm og 405 nm, uden sensibiliserende at demonstrere blandinger af DNA-skader induceret af disse bølgelængder og den indflydelse, disse skader blandinger have på behandlingen reparation afSSBs og DSBs. brugerne skal være klar over, at disse bølgelængder ikke skaber en enkelt art af strand pauser eller base læsioner. For at skelne mellem DNA repair veje, skal brugerne omhyggeligt kontrollere anvendt magt over en specifik region af kernen og karakterisere den inducerede skader ved hjælp af flere strand bryde markører og DNA læsion antistoffer. Hvis korrekt anvendt og karakteriseret, kan laser mikro-bestråling berige nogle arter af DNA-skader, tillade brugernes hen til vurdere reparation af base læsioner og SSBs eller DSBs, med nogle specificitet. Derfor har vi fastsat en metode, tillade brugernes hen til reproducerbar udføre laser mikro-bestråling, karakterisere DNA skader blandinger induceret af den anvendte laser dosis, og udføre dataanalyse.

<table style="border-collapse:collapse;width:548pt" width="730">
	<colgroup>
		<col style="width:220pt" width="293" />
		<col style="width:119pt" width="158" />
		<col style="width:84pt" width="112" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">NIS Elements software</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">355 nm laser</td>
			<td class="xl23">PicoQuant VisUV</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Galvanometer photoactivation miniscanner</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Bruker</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Microscope slide photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S170C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fiber photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S150C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Digital handheld optical power and energy meter</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">PM100D</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">CHO-K1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158"></td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Minimal essential media</td>
			<td class="xl28">Hyclone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">SH3026501</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fetal bovine serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Atlanta biologicals</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S11550</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">XRCC1-GFP</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Origene</td>
			<td class="xl27">RG204952</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Jetprime</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Polyplus transfection</td>
			<td class="xl27">11407</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Geneticin</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl27">10131035</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155382</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">8 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155409</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 53BP-1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Novus</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">NB100304</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti-phospho-histone H2AX&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Millipore</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">05-636-I</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti cyclobutane pyrimidine dimer</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Cosmo Bio clone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">CAC-NM-DND-001</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 8-oxo-2&#180;-deoxyguanosine&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Trevigen</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">4354-MC-050</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 488 goat anti-mouse</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11029</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 546 goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11010</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">R37606</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Phosphate buffered saline</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">0780</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Normal goat serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">31873</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Jackson Immuno Research</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">001-000-162</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">37% Formaldehyde</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">9311</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Ethanol</td>
			<td class="xl20">Decon Labs</td>
			<td class="xl20">2716</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Methanol</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">VWR</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">BDH1135</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">HCl</td>
			<td class="xl20">Fisher</td>
			<td class="xl20">SA49</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Sodium azide</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:84pt" width="112">S2002</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Tris Hydrochloride</td>
			<td class="xl20">Amresco</td>
			<td class="xl20">O234</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Triton X-100</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">T8787</td>
			<td class="xl29"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells

Meget koordineret DNA reparation veje findes for at opdage, punktafgifter og Udskift beskadigede DNA-baser og koordinere reparation af DNA strand pauser. Mens molekylærbiologiske teknikker har afklaret struktur, enzymatiske funktioner og kinetik af reparation proteiner, er der stadig behov for at forstå, hvordan reparation er koordineret i kernen. Laser mikro-bestråling tilbyder et stærkt værktøj til inducerende DNA-skader og overvågning ansættelse af reparation proteiner. Induktion af DNA skader ved laser mikro-bestråling kan forekomme med en vifte af bølgelængder, og brugere kan pålideligt fremkalde enkelt strand pauser, base læsioner og dobbelt strand bryder med en række doser. Her, laser mikro-bestråling bruges til at undersøge reparation af enkelt og dobbelt strand pauser induceret af to fælles Konfokal laser bølgelængder, 355 nm og 405 nm. Yderligere, rette karakterisering af den anvendte laser dosis for at fremkalde bestemte skader blandinger er beskrevet, så brugere kan reproducerbar udføre laser mikro-bestråling dataopsamling og analyse.

Karakterisering af inducerede DNA-skader Induktion af base læsioner og strand pauser er afhængig af den laser dosis anvendes til den valgte nukleare område og de cellulære mikromiljø celle model brugt7. Fluorescerende proteiner sammenvoksede til at reparere proteiner, som XRCC1, 53BP1, Ku70 eller Rad51, give nyttige enkelt og dobbelt aktionsdel pause markører for etablering af den nødvendige at se ophobning af en fluorescerende proteiner inden for en skade ROI ovenstående minimal energi den baggrund fluorescens9,19,31. Når betingelser, der inducerer en svar er fundet, er det kritisk at karakterisere skader blandingen induceret af den specifikke bølgelængde og dosis. Dæmpning af dosis og varighed ved bølgelængden bruges kan tillade bruger hen til bagatellisere dannelsen af komplekse skader blandinger. Lavt laser doser i rækken UV-A er blevet påvist for at producere overvejende SSBs og en lille mængde af base læsioner, passende til at studere SSBR og BER veje10,28. Øge dosis skaber mere kompleks base læsioner, oxidativ og UV-induceret, og inducerer mere betydningsfuldt antal DSBs7,10. Induktion af en enkelt art af DNA-skader er ønskeligt for undersøgelse af specifikke DNA reparation veje, men det er mere sandsynligt, at brugerne overtalelse en blanding af DNA læsioner, med en specifik læsion som SSBs at være meget hyppigere end base læsioner eller DSBs. Dette er lignende til DNA skader blandinger induceret af kemiske agenser som hydrogenperoxid (H2O2) eller methyl methanesulfonate (MMS)32. Brugere skal være opmærksomme, når de rapporterer om resultaterne, der skader blandinger kan forekomme, og omhyggelig karakterisering af dosis og læsioner på webstedet inducerede skader er nødvendige for at sikre reproducerbarhed og sammenlignelighed af resultaterne heraf.
I undersøgelser, mikro-bestråling bruges XRCC1-NGL ofte som en markør for induktion af base læsioner og SSBs9,28. XRCC1 er et stillads protein, som spiller en vigtig rolle i SSB reparation (SSBR) og base excision reparation (BER), og også deltager i andre reparation veje, ligesom nukleotid excision reparation (NER)33,34,35 . Det spiller en vigtig koordinerende rolle i DNA reparation, interagere med en række vigtige proteiner, herunder poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1), DNA polymerase β (Pol β), og DNA ligase III. Vi udnyttede XRCC1-NGL stabilt udtrykt i CHO-K1 celler for at bestemme de laser doser, der kræves til at generere SSBs og DSBs. Vi først identificeret den mindste dosis nødvendig for at fremkalde en observerbar ansættelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis for hver bølgelængde (figur 1). For 355 nm bølgelængde, en 2 s hviletiden over den definerede skader ROI genereret en øget fluorescerende signal inden for det Investeringsafkast, der angiver induktion af DNA-skader, der var spores over baggrunden (fig. 1A). For 405 nm, en 8 fps scan rate var nødvendige for at generere en observerbar rekruttering til skade ROI (fig. 1A). Dosis blev derefter øget (10 s for 355 nm og 0,5 fps til 405 nm) til at oprette en mere intens skade ROI (fig. 1A).
Rekruttering og fastholdelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis i stedet for induceret skade blev derefter overvåges af timelapse billeddannelse. Fastholdelse af protein i stedet for DNA-skader kan indikere igangværende DNA reparation, mens dissociation af protein fra webstedet af inducerede skader er ofte betragtes som en markør for færdiggørelsen af BER eller SSBR. Dog er der ingen klare beviser, der forbinder dissociation af XRCC1 fra laser-induceret DNA skader websteder med færdiggørelsen af reparation. Rekruttering af protein til stedet, hvor skaden er målt ved rapportering betyder intensiteten af de fluorescerende signal inden for den beskadigede ROI over den gennemsnitlige fluorescerende signal målt for hele kernen (figur 1B). Denne form for normalisering hjælper adresse intensitet udsving i den nukleare signal, selvom andre normalisering teknikker kan være ansat afhængigt af den cellulære fordeling af protein af interesse. Her, er XRCC1 lokaliseret i den nukleare rum, så normalisering på det nukleare område måler omfordeling af signalet til skade ROI. ROI gennemsnitlige fluorescerende intensiteten registreres derefter for hvert billede i timelapse, herunder pre skade billedet, og grafen som funktion af tiden (figur 1C).
Vi kendetegnet derefter yderligere skader induceret af de to valgte laser doser at undersøge dannelsen af DNA base læsioner. For det første var dannelsen af CPD, en omfangsrig UV-induceret læsion, probed ved immunfluorescens som markør for NER type læsioner (fig. 2A). Derefter, den oxidativt induceret base lesion8-oxodG var probed som markør for BER type læsioner (figur 2B). Ingen signifikant stigning i CPD læsioner blev observeret på lavdosis udsættelse for begge bølgelængder (2 s for 355 nm og 8 fps til 405 nm), mens høje dosis behandling i både bølgelængder (10 s for 355 nm og 0,5 fps til 405 nm) viste en betydelig stigning i fluorescerende signal observeret inden for skader ROI (fig. 2A). En scatter plot af CPD ROI betyde intensitet for hver beskadigede celle viser heterogenitet i skader dannelsen og registrering på både bølgelængder og doser, der angiver, at et lavt niveau af CPD læsioner kan være til stede på de lavere doser, men belastningen kan ikke være væsentligt opdaget indtil en højere dosis anvendes. Scatterplot foreslår også at ineffektivitet i påvisning af antistof, der kan begrænse nøjagtig kvantificering af skader blandinger.
Det fremhæves yderligere i påvisning af oxidativt induceret DNA læsioner af markør 8-oxodG. Ingen tydelig stigning i fluorescerende signal inden skaden ROI blev observeret for 8-oxodG på enten laser bølgelængde eller dosis anvendes (figur 2B). Antistof anvendes til dette arbejde er i overensstemmelse med tidligere publikationer9,10,36; dog skal det bemærkes, at der kan være begrænsninger i at observere dannelsen af 8-oxodG med antistoffer37,38. Bekræftelse af manglen på oxidativt induceret læsioner er også anbefalet af en anden markør, som ansættelse af 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), enzymet ansvarlig for fjernelse af 8-oxodG fra DNA10. Vi ikke observere OGG1 rekruttering til vores DNA skader websteder; men dannelsen af lave niveauer af oxidativt induceret DNA skader ikke kan udelukkes helt.
Endelig undersøgte vi dannelsen af DSBs ved hjælp af to markører, γH2AX og 53BP-1, på selected laser doser ved immunfluorescens (figur 3 &#38; 4). ΓH2AX er almindeligt anvendt som en strand bryde markør, men dets specificitet for DSBs har spurgt i en række rapporter39,40. Desuden er det en fosforylering begivenhed, der udbreder fra webstedet strand pause så lokalisering af signalet til en strand ferie kan være begrænset på grund af dette signal formering. Derfor, kombinere γH2AX med 53BP-1 giver mulighed for mere præcis vurdering af DSB dannelse inden for skader ROI.
Svar af γH2AX og 53BP-1 til mikro-bestråling er både bølgelængde og dosisafhængige. Den lave dosis (2 s) stimulation på 355 nm fremkalder nogen reaktion på 5 og 20 min, og en svag og variable svar 10 min post bestråling (fig. 3A) for begge markører. Høj dosis (10 s) 355 nm mikro-bestråling inducerer en øget fluorescerende signal inden for skader ROI på 5, 10 og 20 min post bestråling, der er reduceret til 40 min (fig. 3B). Disse resultater tyder på, at omhyggelig med titrering af 355 nm dosis er påkrævet for at minimere cross-stimulation af reparation veje, som det fremgår af den reducerede påvisning af dobbeltstrenget pause markør γH2AX på de tidlige tidspunkt punkter (&#60; 20 min) på den lave dosis anvendes.
Lignende forsøg blev udført ved hjælp af både lav (8 fps) og høj dosis (0,5 fps) 405 nm laser stimulation (figur 4). Ved denne bølgelængde blev betydelige ophobning af fluorescerende intensitet inden for skader ROI observeret for både 53BP-1 og γH2AX uanset anvendte dosis, der angiver, at disse doser genererer en kompleks blanding af enkelt og dobbelt strand bryder næsten umiddelbar efter induktion af DNA-skader (figur 4). Derudover de høje doser af 405 nm viser en stigning i pan-nukleare γH2AX farvning inden for 10 min af skader induktion (fig. 4B, nederst) der vanskeliggør påvisning af skade ROI til rapport, mens en 53BP-1 ophobning er mere indeholdt i skader ROI.
Disse resultater viser tydeligt at 405 nm mikro-bestråling ikke er passende til overvågning af SSBR eller BER, og at flere markører for DNA adukter og strand pauser skal være ansat til fuldt ud at beskrive den inducerede læsioner og DNA reparation svar.
Dosisafhængig ændring i rekruttering og fastholdelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis Når den inducerede DNA-skader er blevet karakteriseret, kan laser mikro-bestråling være en ideel platform for at studere dynamikken i DNA reparation proteiner. XRCC1-normal god landbrugspraksis fastholdelse og dissociation forsvindingskinetik viser en dosis afhængighed (figur 1), som ikke er uventet i betragtning induktion af forskellige skader blandinger af hver bølgelængde. De højeste bestråling doser (10 s og 0,5 fps) viser en højere intensitet rekruttering af XRCC1-normal god landbrugspraksis i forhold til de lavere doser og længere fastholdelse af XRCC1-NGL i stedet for skader i 20 min. tid løbet (figur 1C). Dette indikerer, at DNA-skader oprettet ved højere doser for både 355 og 405 nm er sandsynligvis ikke løst i løbet af eksperimentet, som er i overensstemmelse med det udseende og fastholdelse af DSB markører, γH2AX og 53BP-1 (figur 3 &#38; 4 ).
Interessant, Vis de lavere skader doser (2 s og 8 fps) hurtig ansættelse af XRCC1-NGL til skade websteder og dissociation af XRCC1-normal god landbrugspraksis i eksperimentel tid løbet før bestråling niveauer (figur 1C). Uden komplet karakterisering af skader blandingen, kan dette føre til den konklusion, at SSBs og base læsioner er helt løst ved hjælp af disse skadelige betingelser. Men tilstedeværelsen af γH2AX og 53BP-1 ved 40 min. til 355 nm og 5 min. til 405 nm kan føre til forskellige fortolkninger. For 355 nm 2 s dosis, skader blandingen kan være overvejende SSBs, så udseendet af DSB markører på 40 min tyde på at nogle unrepaired læsioner kan føre til DSBs eller at DSBs genereret af denne energi er repareret på en længere tidshorisont. Skala tidsforskelle mellem SSBR og DSB reparation har været tidligere rapporteret28,41,42. På samme måde, 405 nm lav dosis (8 fps) dissociation kan indikere et lavt niveau af SSBs eller en klynge af SSBs, der hurtigt omdannes til DSBs, som har været kendt for høj skade mikro-bestråling og andre DNA skadelige agenser tidligere43, 44 , 45.
Sammen disse resultater fremhæve betydningen af kendetegner induceret skade blandinger og udnytter flere DNA reparere proteiner og markører for at fortolke rekruttering og fastholdelse af DNA reparere proteiner på lokaliteter af induceret skade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
Figur 1 . Laser mikro-bestråling inducerer ansættelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis.  (A) CHO-K1 celler stabilt udtrykker XRCC1-normal god landbrugspraksis var bestrålet og afbildet før og umiddelbart efter skader induktion. Pilene angiver placeringen af mikro-bestråling dosis og skalalinjen er 10 µm. (B) rekruttering er målt ved bestemmelse af den gennemsnitlige fluorescerende intensitet inden for skader ROI og normalisering betyder fluorescerende intensiteten af den hele kernen. (C) Dynamics af ansættelse kan måles for hvert timelapse billede. Grafer er repræsentant for to uafhængige forsøg med fejllinjer repræsenterer SEM (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
Figur 2 . Laser mikro-bestråling inducerer nukleotid skader.  CHO-K1 celler blev udsat for laser mikro-bestråling og fast umiddelbart efter skader induktion. Immunfluorescens blev udført for at opdage CPD og 8-oxodG adukter. (A) top, scatter plot af ROI gennemsnitlige fluorescens intensiteter observeret i beskadigede celler efter CPD farvning. Bunden, repræsentative billeder af CPD farvning. Pilene angiver placeringen af mikro-bestråling og skalalinjen er 10 µm (n = 12). (B) repræsentative billeder for 8-oxodG farvning. PileAngiver placeringen af mikro-bestråling og skalalinjen er 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
Figur 3 . DNA dobbeltstrenget pause markører reagerer på 355 nm mikro-bestråling i en dosis afhængige måde.  CHO-K1 celler blev udsat for mikro-bestråling og fast på den tid punkter angivet efter stimulation. Immunfluorescens for DSB markører γH2AX og 53BP-1 blev udført. (A) scatter plot af normaliserede skader ROI betyde fluorescens intensiteter målt for ubeskadigede og beskadigede celler. Fejllinjer er repræsentative for SEM (n = 12). (B) repræsentative billeder for γH2AX og 53BP-1 farvning. Pilene angiver placeringen af mikro-bestråling og skalalinjen er 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
Figur 4. DNA dobbeltstrenget pause markører håndfast reagere på 405 nm mikro-bestråling. CHO-K1 celler blev udsat for mikro-bestråling og fast på tid punkter anførte indlæg stimulation. Immunfluorescens for DSB markører γH2AX og 53BP-1. (A) scatter plot af normaliserede skader ROI betyde fluorescens intensiteter målt for ubeskadigede og beskadigede celler. Fejllinjer er repræsentative for SEM (n = 12). (B) repræsentative billeder for γH2AX og 53BP-1 farvning. Pilene angiver placeringen af mikro-bestråling og skalalinjen er 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Anvendelsen af Laser mikro-bestråling for undersøgelse af enkelt og dobbelt Strand bryde reparation i pattedyrceller

Konfokal Fluorescens mikroskopi og laser mikro-bestråling tilbyder værktøjer til inducerende DNA-skader og overvåge svaret fra DNA reparation proteiner i udvalgte sub nukleare områder. Denne teknik har betydeligt avancerede vores kendskab til skader påvisning, signalering og rekruttering. Dette manuskript viser disse teknologier for at undersøge enkelt og dobbelt strand bryde reparation.

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Counting proteiner i enkelt celler med adresserbare Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunfluorescens mikroskopi af γH2AX og 53BP1 til at analysere den dannelse og reparation af DNA dobbelt-strenget pauser

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

Anvendelsen af 1% methylenblåt farvestof som en enkelt teknik i brystkræft Sentinel node biopsi

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Kendetegner DNA reparationsprocesser på forbigående og langvarig dobbelt-strenget DNA pauser ved immunfluorescens mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Imaging af DNA-skader og reparation Foci i Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

En reporterassay for at analysere intronisk mikroRNA-modning i pattedyrceller

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modellering af hjernemetastase ved intern halspulsåreinjektion af kræftceller

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortopisk implantation af patientafledte kræftceller hos mus rekapitulerer avanceret kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisering af DNA-skadereparationsproteiner i patientafledte ovariecancerorganoider via immunofluorescensassays

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

Anvendelse af AlDeSense til stratificering af kræftceller i æggestokkene baseret på aldehyddehydrogenase 1A1-aktivitet

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...