Name: application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

De auteurs bedank Dr. Samuel H. Wilson op het National Institute of Environmental Health Sciences voor de cellijnen in dit werk gebruikt.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met behulp van de voorwaarden beschreven hier, kan elke confocal microscoop met een UV-A of 405 nm laser, geïntegreerd door de fabrikant of toegevoegd door de eindgebruiker, veroorzaken schade van DNA binnen de kern van een cel en laat de aanwerving van DNA reparatie eiwitten op de site van geïnduceerde DNA-schade te worden gevolgd. Echter, zoals vermeld in het protocol en de representatieve resultaten, golflengte selectie, toegepast macht, en karakterisering van de schade zijn alle belangrijke kwesties die eerst door de gebruiker moeten worden aangepakt om te bestuderen van een specifieke DNA herstel traject. Daarnaast zijn er andere overwegingen in experimenteel design die ook door gebruikers moet worden beschouwd.
Om te kunnen volgen van een proteïne gedrag in levende cellen post micro-bestraling, een fluorescently geëtiketteerde eiwit moet worden gemaakt. De beschikbaarheid van een breed scala van fluorescente proteïnen die spectraal kunnen worden gescheiden biedt tools voor het maken van eiwit fusies die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van cellulaire reacties op de inductie van DNA-schade. Voorbijgaande Transfectie van fluorescente proteïnen van belang zorgt voor snelle screening van schadelijke voorwaarden, mutaties of zelfs remmers, terwijl stabiel transfected cellen bieden meer controle over expressie niveaus en voorzien in andere biochemische karakterisaties moet worden uitgevoerd, micro-bestraling resultaten te valideren. Spectraal verschillende fluorescente proteïnen kunnen ook worden gebruikt in dezelfde cel te controleren van de interacties tussen eiwitten binnen de zelfde pathway of in verschillende trajecten. Fluorescerende eiwitten ook elimineren de noodzaak voor specifieke antilichamen tegen elke proteïne van belang en toestaan dat levende cel monitoring van eiwit gedrag voor langere tijd na de inductie van schade.
Het gebruik van fluorescente proteïnen heeft echter ook nadelen. Zonder genetische achtergronden tekort aan de expressie gebrachte eiwitten van belang, zal endogene eiwitten concurreren met de fluorescently tagged eiwitten. Vervoeging van de TL-tag aan de N- of C-terminus van het eiwit kan veranderen vouwing van eiwitten, belangrijkste eiwit-eiwitinteractie belemmeren of blokkeren van de translocatie signalen; veranderen van functie en potentieel beïnvloeden werving dynamiek. Deze effecten zijn aangetoond in een aantal verslagen waar immunefluorescentie kleuring aangetoond drastisch verschillende werving en retentietijden voor endogene eiwitten op de schade site28. Gebruik van voorbijgaande transfectie of stabiele klonen kan ook de respons waargenomen, meestal door variaties in eiwitniveaus expressie wijzigen. Verder, het gebruik van meerdere TL eiwitten in een enkele experiment in te stellen, de dynamiek van werving, ook kan wijzigen als eiwitniveaus niet goed zijn geëquilibreerd of als werving van het grotere fluorescently-tagged eiwit de aanwerving van andere eiwitten blokkeert . Ten slotte, fluorescente proteïnen kunnen fungeren als zwakke sensibilisatie agenten, verhoging van de vorming van reactieve zuurstof soorten en potentieel het wijzigen van de DNA schade mengsels geïnduceerde46,47. Ondanks deze nadelen bieden fluorescente proteïnen een aantal duidelijke voordelen in studeren DNA herstellen met micro-bestraling en als gebruikers passende besturingselementen, zoals de karakterisering van de schade hier beschreven nemen, kan zij nieuw inzicht in schade respons en eiwit-eiwit interacties3.
Als levende cel imaging niet vereist is, kan immunofluorescentie worden gebruikt om te controleren de reactie veroorzaakte schade. Post schade inductie en kleuring met antilichamen specifiek voor eiwitten en letsels van belang, statische momentopnamen van de inductie van de schade en de werving en retentie van reparatie eiwitten kunnen worden gebouwd door de vaststelling van cellen op specifieke tijden. Antilichamen kunnen worden gebruikt om te controleren de aanwerving van meerdere proteïnen van belang en/of posttranslationele modificaties veroorzaakt door de reactie van DNA schade. Gebruik van immunofluorescentie elimineert de noodzaak van fluorescente proteïnen, en zorgt voor de endogene eiwit gedrag worden onderzocht. Echter, deze methode heeft ook nadelen. Zeer specifieke antilichamen nodig zijn, en permeabilization en blokkerende procedures moeten worden geoptimaliseerd zodat voor detectie van werving met voldoende signaalsterkte. Fixing procedures zijn niet onmiddellijk, en deze fysieke beperking beperkt de temporele resolutie van deze aanpak. De site van de inductie van de schade in kaart brengen, zodat de cellen zich kunnen bevinden opnieuw na kleuring kan ook presenteren belangrijke uitdagingen. De confocal microscoop gebruikt in dit werk zorgt voor beeld-gebaseerde registratie zoals hierboven beschreven, zodat beschadigde cellen kunnen worden verplaatst met hoge precisie. Als fase registratie of geëtst dekglaasje niet beschikbaar, de tijd die investeringen betrokken is bij kunnen verhuizen cellen zonder podium registratie, gekoppeld aan de inherente vertraging tussen schade inductie en de verbeelde werving, immunofluorescentie maken onaantrekkelijk aan sommige gebruikers. De meest nauwkeurige en volledige micro-bestraling van de experimentele designs zal echter dit soort benaderingen in parallel met het gebruik van fluorescente proteïnen, opnemen, zoals beschreven in het voorgestelde protocol.
Hier, wordt zowel levende cel beeldvorming en immunofluorescentie gebruikt om aan te tonen het nut van micro-laser-bestraling. Immunefluorescentie kleuring laat ons toe om het mengsel van DNA-schade gemaakt nauwkeurig te onderzoeken en de aanwerving van eiwitten geïnduceerd door elke laser macht, die ons in staat beter te stellen interpreteren de waargenomen veranderingen in de werving en het behoud van XRCC1-GFP. Op basis van deze resultaten, moet het gebruik van 405 nm lasers worden beperkt voor onderzoek van BER en SSBR eiwitten. Verder, de optimale proefopzet macht metingen zou omvatten na de doelstelling, een karakterisering van het mengsel van de volledige schade voor elke regel van de cel gebruikt en validatie van de werving en retentie waargenomen fluorescently gecodeerde eiwitten met immunofluorescentie. Uiteraard, apparatuur, tijd en kosten-overwegingen kunnen maken deze optimale experimentele designs onmogelijk voor sommige gebruikers. Echter het belang van elk van deze elementen blijkt hier, en gebruikers moeten deze overwegingen in gedachten houden bij het begin van micro-bestraling experimenten.

Fluorescent microscopie heeft ontpopt als een krachtige techniek voor het visualiseren van cellulaire het platform, onderzoeken lokalisatie van eiwit en eiwit-eiwit en eiwit-DNA interacties. Met behulp van fluorescentie microscopie te bestuderen van DNA schade reacties na de toepassing van mondiale DNA beschadigen van agenten, zoals ultraviolet (UV) licht, heeft ioniserende straling, chemische oxidatie of alkylerend agentia, en/of chemotherapeutica nieuw inzicht in de inleiding, signalering en aanwerving van DNA herstellen eiwitten naar sites voor DNA schade1,2. Echter, deze mondiale en asynchrone gebeurtenissen schadelijk zijn beperken, als gedetailleerde informatie over de werving order, de kinetiek van de vereniging of dissociatie, en de relaties tussen belangrijke DNA reparatie eiwitten worden gezocht. Gelukkig, vooruitgang in laser confocal microscopen scannen, bredere beschikbaarheid van schade-inducerende laser golflengten en verbeteringen in fluorescente proteïnen ten opzichte van de afgelopen 25 jaar hebben verstrekt onderzoekers met verbeterde hulpmiddelen voor de behandeling van deze aspecten van DNA herstellen, door middel van gerichte DNA schade inductie.
Bestraling van cellen met laser microbeams te bestuderen van cellulaire en subcellular functies is een gevestigde hulpmiddel in cel en straling biologie3. Toepassing van deze techniek op de studie van DNA-herstel is verschenen toen Cremer en medewerkers een zeer gerichte UV gebruikt (257 nm) laser microbeam systeem voor het opwekken van DNA-beschadiging over een 0,5 µm plek in Chinese hamster ovary (CHO)4 cellen en de inductie van gevestigde De photolesions van DNA door dit systeem5. Terwijl biedt aanzienlijke verbeteringen over UV microbeam methoden op het moment, de aanneming van dit systeem schadelijk was beperkt als gevolg van haar gespecialiseerde instellen en haar onvermogen om te genereren breekt dubbele streng (DSBs)6. Daaropvolgend onderzoek van een verscheidenheid van UV-B (290-320 nm) en UV-een golflengten (320-400 nm) door een aantal fracties geopenbaard dat UV-photoproducts, oxidatieve laesies baseren, enkele streng breekt (SSBs), en DSBs afhankelijk van de golflengte van de laser kan worden geïnduceerd en macht toegepast4,7,8,9,10 (herzien in 3). Verder, combinaties van deze UV-B en UV-A golflengte met sensibiliserende stoffen, zoals psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) en Hoechst kleurstoffen, werden ook gevonden voor het opwekken van DNA-schade afhankelijk van golflengte, kracht en duur van de blootstelling, hoewel de kracht nodig om te veroorzaken schade is vaak verlaagd in de aanwezigheid van deze agenten11,12,13,14,15. Deze vorderingen uitgebreid het gebruik van micro-bestraling, al waren er nog technische hindernissen voor bredere toepassing van deze methoden worden aangepakt.
Cremer en medewerkers schoven aanzienlijk het gebied van micro-bestraling van juist gericht de UV microbeam om toe te passen significante schadelijke energie over een uiterst gelokaliseerde gebied in de cel. Zoals confocal microscopen en microdissection lasersystemen geavanceerde, was strak gericht licht meer in het algemeen toegankelijk zijn; echter gepresenteerd UV bronnen koppelen aan scopes en het omgaan met de chromatische aberraties die ze nog geïnduceerde belangrijke uitdagingen voor de meeste gebruikers3,-6,16. UV kleurstoffen steeg in populariteit gedurende de jaren 1990, optica staat van zich te concentreren en vastleggen UV-opgewonden fluorescentie werd breder beschikbaar16en verbeteringen in laser scannen aangeboden gebruikers de mogelijkheid te maken zeer gericht UV excitatie plekken binnen cellen6,17. Het was echter niet tot de vroege 2000s dat de werkelijke impact van deze combinatie van strak gerichte balken met hogere intensiteit lasers was voelde, toen talrijke rapporten naar voren waaruit blijkt gekomen dat DNA strand einden kon worden opgewekt met en zonder allergenen in de UV-A bereik6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, en zelfs in de meer zichtbare golflengten zoals 488 nm27. Deze vorderingen mogen voor meer wijdverspreide goedkeuring van de techniek van de micro-bestraling op een aantal commerciële systemen. Parallel aan deze ontwikkelingen, twee-foton technieken ook naar voren gekomen waardoor nauwkeurige inductie van DNA-schade; Hoewel deze vooruitgang zal niet hier worden besproken, zijn er een aantal artikelen van de beoordeling over deze methodologieën9,28,29,30.
Met de huidige toegankelijkheid van confocal microscopen geschikt voor het leveren van zeer gerichte UV-licht en de wijdverspreide beschikbaarheid van fluorescente proteïnen toe real-time tracking van DNA reparatie eiwitten, micro-bestraling technieken uitgegroeid tot krachtige hulpmiddelen voor de behandeling van DNA schade reactie en reparatie trajecten. Nochtans, moeten de gebruikers zich bewust zijn dat de generatie van DNA-schade sterk afhankelijk van de golflengte van de laser en de kracht toegepast op het sub nucleair gebied is. Gebruik van UV-C (~ 260 nm) golflengten kunnen directe DNA excitatie en hoge selectiviteit voor de inductie van UV photoproducts7,8. UV-B en UV-A golflengte produceren mengsels van DNA-schade (base laesie, SSBs en DSBs), afhankelijk van de toegepaste kracht en de cellulaire achtergrond gebruikt7. Endogene photosensitizers en anti-oxydant niveaus in de gerichte cellen kunnen beïnvloeden de DNA schade mengsels geproduceerd door deze golflengten. Bovendien is het gebruik van exogene photosensitizers (BrdU, enz.) kan bijstaan bij het verlagen van de energie die nodig is voor de inductie van DNA-schade. Echter deze agenten DNA schade kunnen veroorzaken door zichzelf, en ze kunnen het wijzigen van de celcyclus en de structuur van de chromatine, zodat het gebruik ervan kan leiden tot ongewenste effecten die moeten worden genomen door de gebruiker. Daarom is zorgvuldige afweging van het DNA-reparatie-traject van belang, de golflengten beschikbaar voor gebruik, en het DNA schade mengsel gemaakt voorafgaand aan het gebruiken van micro-bestraling DNA schade reactie en reparatie te studeren, vereist.
Hier, laser-micro-bestraling wordt uitgevoerd op twee gangbare golflengten, 355 nm en 405 nm, zonder sensibilisatoren om aan te tonen van de mengsels van DNA-schade veroorzaakt door deze golflengtes en de invloeden die deze schade mengsels hebben op het onderzoek van de reparatie vanSSBs en DSBs. de gebruikers moeten zich ervan bewust dat deze golflengten Maak geen een enkele soorten strand einden of base laesies. Om te discrimineren tussen DNA-reparatie-trajecten, moeten gebruikers zorgvuldig controle van de toegepaste kracht over een bepaalde regio van de kern en karakteriseren van de veroorzaakte schade gebruik van meerdere strand break markeringen en DNA laesie antilichamen. Indien goed toegepast en gekenmerkt, kan laser-micro-bestraling verrijken sommige soorten DNA-beschadiging, toestaand gebruikers om te beoordelen van reparatie van base laesies en SSBs of DSBs, met sommige specificiteit. Daarom hebben wij een methode waardoor gebruikers kunnen reproducibly uitvoeren van laser-micro-bestraling, karakteriseren de DNA schade mengsels geïnduceerd door de toegepaste laser dosis en gegevensanalyses uitvoeren verstrekt.

<table style="border-collapse:collapse;width:548pt" width="730">
	<colgroup>
		<col style="width:220pt" width="293" />
		<col style="width:119pt" width="158" />
		<col style="width:84pt" width="112" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">NIS Elements software</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">355 nm laser</td>
			<td class="xl23">PicoQuant VisUV</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Galvanometer photoactivation miniscanner</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Bruker</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Microscope slide photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S170C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fiber photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S150C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Digital handheld optical power and energy meter</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">PM100D</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">CHO-K1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158"></td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Minimal essential media</td>
			<td class="xl28">Hyclone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">SH3026501</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fetal bovine serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Atlanta biologicals</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S11550</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">XRCC1-GFP</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Origene</td>
			<td class="xl27">RG204952</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Jetprime</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Polyplus transfection</td>
			<td class="xl27">11407</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Geneticin</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl27">10131035</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155382</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">8 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155409</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 53BP-1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Novus</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">NB100304</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti-phospho-histone H2AX&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Millipore</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">05-636-I</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti cyclobutane pyrimidine dimer</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Cosmo Bio clone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">CAC-NM-DND-001</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 8-oxo-2&#180;-deoxyguanosine&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Trevigen</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">4354-MC-050</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 488 goat anti-mouse</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11029</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 546 goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11010</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">R37606</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Phosphate buffered saline</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">0780</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Normal goat serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">31873</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Jackson Immuno Research</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">001-000-162</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">37% Formaldehyde</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">9311</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Ethanol</td>
			<td class="xl20">Decon Labs</td>
			<td class="xl20">2716</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Methanol</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">VWR</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">BDH1135</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">HCl</td>
			<td class="xl20">Fisher</td>
			<td class="xl20">SA49</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Sodium azide</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:84pt" width="112">S2002</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Tris Hydrochloride</td>
			<td class="xl20">Amresco</td>
			<td class="xl20">O234</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Triton X-100</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">T8787</td>
			<td class="xl29"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells

Sterk gecoördineerde DNA repair pathways bestaan om te detecteren, accijnzen en vervanging van beschadigde DNA-basen en coördineren van de reparatie van DNA strand einden. Terwijl moleculaire biologietechnieken hebben verduidelijkt structuur, enzymatische functies en kinetiek van reparatie eiwitten, is er nog steeds een noodzaak om te begrijpen hoe reparatie wordt gecoördineerd binnen de kern. Laser-micro-bestraling biedt een krachtig hulpmiddel voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de werving van reparatie eiwitten. Inductie van DNA-schade door laser-micro-bestraling kan optreden met een reeks van golflengtes en gebruikers op betrouwbare wijze kunnen veroorzaken enkele streng pauzes, basis laesies en dubbele strand einden met een aantal doses. Hier, laser-micro-bestraling wordt gebruikt om te onderzoeken van de reparatie van enkele en dubbele streng einden geïnduceerd door twee gemeenschappelijke confocale laser golflengten, 355 nm en 405 nm. Verdere, juiste karakterisering van de toegepaste laser dosis voor specifieke schade mengsels inducerende wordt beschreven, zodat gebruikers reproducibly laser micro-bestraling data-acquisitie en analyse uitvoeren kunnen.

Karakterisering van geïnduceerde DNA-schade Inductie van base laesies en strand einden is afhankelijk van de dosis van de laser toegepast op het geselecteerde gebied van de nucleaire en de mobiele communicatie van de cel model7gebruikt. Fluorescente proteïnen gesmolten om te herstellen van eiwitten, zoals XRCC1, 53BP1, Ku70 of Rad51, voorzien van nuttige single en dubbele strand einde markeringen voor het vaststellen van de minimale energie die nodig is om te zien van accumulatie van een fluorescente proteïne binnen een schade ROI boven de achtergrond fluorescentie9,19,31. Zodra voorwaarden die een antwoord induceren worden gevonden, is het essentieel te karakteriseren van het mengsel van de schade veroorzaakt door die specifieke golflengte en dosis. Demping van de dosis en de duur bij de gebruikte golflengte kunt de gebruiker toestaan te minimaliseren van de vorming van complexe schade mengsels. Hebben aangetoond dat lage laser doses in het bereik van de UV-A produceren voornamelijk SSBs en een kleine hoeveelheid base laesies, geschikt voor het bestuderen van SSBR en BER trajecten10,28. Verhoging van de dosis leidt tot meer complexe basis laesies, oxidatieve en UV geïnduceerde en induceert meer grote aantallen DSBs7,10. Hoewel de inductie van een enkele soorten DNA-beschadiging wenselijk voor behandeling van specifieke DNA-reparatie-studierichtingen is, is het waarschijnlijker dat gebruikers een mengsel van DNA laesies, met een specifieke laesie zoals SSBs wordt veel vaker dan base laesies of DSBs zijn inducerende. Dit is gelijkaardig aan DNA schade mengsels geïnduceerd door chemische agentia zoals waterstof peroxide (H2O2) of een methyl methanesulfonate (MMS)32. Gebruikers moeten zich bewust zijn wanneer zij rapporteert resultaten die schade toebrengen aan mengsels kunnen optreden, en zorgvuldige karakterisering van de dosis en de letsels op de site van de veroorzaakte schade zijn noodzakelijk om ervoor te zorgen de reproduceerbaarheid en de vergelijkbaarheid van de resultaten.
Micro-bestraling studies, wordt XRCC1-GFP vaak gebruikt als een marker voor de inductie van base laesies en SSBs9,28. XRCC1 is een steiger-eiwit dat een belangrijke rol in SSB reparatie (SSBR speelt) en base excision herstellen (BER), en neemt ook deel aan andere reparatie-trajecten, zoals nucleotide excisie reparatie (NER)33,34,35 . Het speelt een belangrijke coördinerende rol in DNA-herstel, interactie met een aantal belangrijke eiwitten, met inbegrip van poly(ADP-ribose) polymerase van DNA Taq β 1 (PARP-1), (Pol β), en DNA ligase III. We gebruikt XRCC1-GFP stabiel uitgedrukt in CHO-K1 cellen om te bepalen van de laser doses vereist voor het genereren van SSBs en DSBs. We voor het eerst geïdentificeerd de minimale dosis die nodig is voor het opwekken van een waarneembare werving van XRCC1-GFP voor elke golflengte (Figuur 1). Voor de 355 nm golflengte, een 2 s Nadruktijd over de gedefinieerde schade ROI gegenereerd een verhoogde fluorescent signaal binnen dat ROI, met vermelding van de inductie van DNA schade, die aantoonbaar werd op de achtergrond (Figuur 1A). Voor 405 nm, een tarief van 8 fps scan nodig was voor het genereren van een waarneembare werving de schade ROI(Figuur 1). De dosis werd vervolgens verhoogd (10 s voor 355 nm en 0.5 fps voor 405 nm) maken een meer intense schade ROI(Figuur 1).
Werving en behoud van XRCC1-GFP op de site van geïnduceerde schade werd vervolgens gecontroleerd door timelapse imaging. Retentie van het eiwit op de site van DNA-beschadiging kan geven gaande DNA-herstel, terwijl de dissociatie van het eiwit van de site van geïnduceerde schade wordt vaak beschouwd als een marker voor voltooiing van BER of SSBR. Er is echter geen duidelijk bewijs koppelen de dissociatie van XRCC1 van laser-geïnduceerde DNA schade sites met de voltooiing van de reparatie. Werving van het eiwit op de site van schade wordt gemeten door de gemiddelde intensiteit van de fluorescentie signaal binnen de beschadigde ROI rapportage over het gemiddelde fluorescent signaal gemeten voor de gehele kern (Figuur 1B). Dit soort normalisatie helpt adres intensiteit schommelingen in het nucleaire signaal, hoewel andere normalisatie technieken kunnen worden gebruikt afhankelijk van de cellulaire verdeling van de proteïne van belang. Hier, is XRCC1 gelokaliseerd in de nucleaire compartiment, zodat normalisatie op nucleair gebied de herverdeling van het signaal naar de schade ROI maatregelen. De gemiddelde TL intensiteit ROI wordt vervolgens geregistreerd voor elke afbeelding in de timelapse, met inbegrip van de pre schade afbeelding, en opgenomen in een grafiek als een functie van de tijd (Figuur 1C).
Wij vervolgens verder gekenmerkt met de schade veroorzaakt door de twee geselecteerde laser doses te bestuderen van de vorming van DNA basis laesies. Vorming van BPR, een omvangrijk UV-geïnduceerde laesie, was eerst, door immunofluorescentie gesondeerd als merkstof voor NER type laesies(Figuur 2). Vervolgens werd de oxidatively geïnduceerde basis lesion8-oxodG gesondeerd als merkstof voor BER type laesies (Figuur 2B). Geen significante toename van de CPD laesies werden waargenomen bij de lage dosis blootstelling voor beide golflengten (2 s voor 355 nm en 8 bps voor 405 nm), terwijl de hoge dosis behandeling bij beide golflengten (10 s voor 355 nm en 0.5 fps voor 405 nm) vertoonde een aanzienlijke stijging in TL het signaal wordt waargenomen binnen de schade ROI(Figuur 2). Een scatterplot van de CPD ROI betekenen intensiteit voor elke beschadigde cel toont heterogeniteit in de vorming van de schade en opsporing bij zowel golflengtes en doses, die aangeeft dat een laag niveau van CPD laesies aanwezig bij de lagere doses kan zijn, maar de belasting niet aanzienlijk kan worden gedetecteerd tot een hogere dosis wordt toegepast. De scatterplot suggereert ook dat inefficiëntie in de opsporing van antilichamen die nauwkeurige kwantificering van de mengsels van de schade kan beperken.
Dit is verder benadrukt in de opsporing van oxidatively geïnduceerde DNA-beschadigingen door de marker 8-oxodG. Geen duidelijke stijging fluorescent signaal binnen de schade ROI werd waargenomen voor 8-oxodG op de golflengte van de laser of dosis gebruikt (Figuur 2B). Het antilichaam gebruikt voor dit werk is in overeenstemming met eerdere publicaties9,10,36; echter, opgemerkt moet worden dat er beperkingen in het observeren van de vorming van 8-oxodG met antilichamen37,38kan zijn. Bevestiging van het ontbreken van oxidatively geïnduceerde letsels wordt ook aanbevolen door een tweede markeerdraad, zoals werving van 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), het enzym verantwoordelijk voor de verwijdering van 8-oxodG van de DNA-10. We deden niet observeren OGG1 werving aan onze DNA schade plaatsen; worden echter, de vorming van lage niveaus van oxidatively geïnduceerde DNA-schade kan niet uitgesloten volledig.
Ten slotte, onderzochten we de vorming van DSBs met behulp van twee markeringen, γH2AX en 53BP-1, bij de selected laser doses met immunofluorescentie (Figuur 3 &#38; 4). ΓH2AX wordt vaak gebruikt als een strand break marker, maar zijn specificiteit voor DSBs heeft gesteld in een aantal verslagen39,40. Bovendien is het een fosforylatie evenement dat zich van de strand vakantie site, voortplant zodat de lokalisatie van het signaal naar een strand vakantie kan worden beperkt als gevolg van het doorgeven van dit signaal. Daarom zorgt combineren γH2AX met 53BP-1 voor een nauwkeurigere beoordeling van DSB formatie in het schade ROI.
De reactie van γH2AX en 53BP-1 op micro-bestraling is zowel golflengte en dosis afhankelijk. De lage dosis (2 s) stimulatie op 355 nm ontlokt geen reactie op de 5 en 20 min, en een zwak en variabele reactie 10 min post bestraling (Figuur 3A) voor beide markeerders. De hoge dosis (10 s) van 355 nm micro-bestraling induceert een verhoogde fluorescent signaal binnen de schade ROI op 5, 10 en 20 min post bestraling die op 40 min (Figuur 3B) wordt verminderd. Deze resultaten wijzen erop dat zorgvuldige titratie van de 355 nm dosis is vereist om te minimaliseren van de Kruis-stimulatie van reparatie trajecten, zoals aangetoond door de verminderde detectie van de dubbele strand break markering γH2AX in de vroege tijd punten (&#60; 20 min) bij de lage dosis toegepast.
Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd met behulp van zowel de lage (8 bps) en de hoge dosis (0.5 fps) 405 nm laser stimulatie (Figuur 4). Bij deze golflengte werd aanzienlijke accumulatie van fluorescerende intensiteit binnen de schade ROI waargenomen voor zowel 53BP-1 en γH2AX ongeacht de toegepaste dosis, die aangeeft dat deze doses bijna een complex mengsel van enkele en dubbele streng pauzes genereren direct na de inductie van DNA-schade (Figuur 4). Bovendien, de hoge doses van 405 nm show een toename van de pan-nucleaire γH2AX kleuring binnen 10 min van schade inductie (Figuur 4B, bodem) dat maakt detectie van de schade ROI moeilijk verslag, terwijl de accumulatie van de 53BP-1 is meer deel uitmaakt van de schade ROI.
Deze resultaten tonen duidelijk aan dat de 405 nm micro-bestraling niet geschikt is voor SSBR of BER toezicht, en dat meerdere markeringen voor DNA adducten en strand einden moeten worden aangewend om te volledig karakteriseren de geïnduceerde laesies en DNA repair reacties.
Dosis-afhankelijke wijziging in de werving en het behoud van XRCC1-GFP Zodra de geïnduceerde DNA-schade heeft gekenmerkt, kunnen laser-micro-bestraling een ideaal platform voor het bestuderen van de dynamiek van DNA reparatie eiwitten. De retentie en dissociatie kinetiek van de XRCC1-GFP toont een dosis afhankelijkheid (Figuur 1), die niet onverwacht de inductie van mengsels van verschillende schade die elke golflengte is. De hoogste dosis van de bestraling (10 s en 0,5 bps) tonen een hogere intensiteit aanwerving van XRCC1-GFP ten opzichte van de lagere doses en langere bewaring van de XRCC1-GFP op de site van schade in de 20 min tijdsverloop (Figuur 1C). Dit geeft aan dat de DNA-beschadiging gemaakt bij hogere doseringen voor zowel 355 en 405 nm is waarschijnlijk niet opgelost in de loop van het experiment, dat met het uiterlijk en de retentie van DSB markeringen, γH2AX en 53BP-1 strookt (figuren 3 &#38; 4 ).
Interessant is dat Toon de lagere doses van de schade (2 s en 8 bps) snelle aanwerving van XRCC1-GFP naar de sites van de schade en de dissociatie van XRCC1-GFP in de tijdsverloop van de experimentele aan de pre bestraling niveaus (Figuur 1C). Zonder de volledige karakterisering van de schade-mengsel, kan dit leiden tot de conclusie dat de SSBs en base letsels volledig opgelost met behulp van deze schadelijke voorwaarden. Echter de aanwezigheid van γH2AX en 53BP-1 op 40 minuten voor 355 nm en op 5 min voor de 405 nm tot verschillende interpretaties kan leiden. Voor de 355 nm 2 s dosis, kan het mengsel van de schade worden voornamelijk SSBs, zodat het uiterlijk van DSB markers op 40 min erop duiden kan dat bepaalde herstelde laesies tot DSBs leiden kunnen of dat DSBs gegenereerd door deze energie op een langere tijdschaal worden gerepareerd. Schaal tijdverschillen tussen SSBR en DSB reparatie geweest eerder gemelde28,41,42. Ook de 405 nm lage dosis (8 bps) dissociatie kan duiden op een laag niveau van SSBs of een clustering van SSBs die snel worden omgezet in DSBs, die is vastgesteld voor hoge schade micro-bestraling en andere DNA beschadigen agenten eerder43, 44 , 45.
Samen deze resultaten benadrukken het belang van het karakteriseren van de veroorzaakte schade mengsels en eiwitten met behulp van meerdere DNA repair en markeringen voor het interpreteren van de werving en het behoud van DNA herstellen eiwitten op sites van veroorzaakte schade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
Figuur 1 . Laser-micro-bestraling induceert aanwerving van XRCC1-GFP.  (A) de CHO-K1 cellen uiten stabiel XRCC1-GFP waren bestraald en beeld vóór en meteen na de inductie van de schade. Pijlen geven aan waar micro-bestraling dosis en schaal bar is 10 µm. (B) Recruitment wordt gemeten door bepaling van de gemiddelde TL intensiteit binnen de schade ROI en normaliseren tot de gemiddelde TL intensiteit van de gehele kern. (C) de dynamiek van werving kan worden gemeten voor elke afbeelding timelapse. Grafieken zijn vertegenwoordiger van twee onafhankelijke experimenten met foutbalken vertegenwoordigen de SEM (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
Figuur 2 . Laser-micro-bestraling induceert nucleotide schade.  CHO-K1 cellen waren onderworpen aan laser micro-bestraling en vaste onmiddellijk na schade inductie. Immunofluorescentie werd uitgevoerd om te detecteren CPD en 8-oxodG adducten. (A) boven, scatterplot van de ROI gemiddelde fluorescentie intensiteiten waargenomen in beschadigde cellen na CPD kleuring. Bodem, representatieve beelden van CPD kleuring. Pijlen geven aan waar micro-bestraling en de schaal bar is 10 µm (n = 12). (B) de vertegenwoordiger beelden voor 8-oxodG kleuring. Pijlenaangeven van de locatie van micro-bestraling en de schaal bar is 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
Figuur 3 . DNA dubbele strand break merkers reageren op 355 nm micro-bestraling op een dosis-afhankelijke wijze.  CHO-K1 cellen waren onderworpen aan micro-bestraling en vastgesteld op de tijd punten aangegeven na stimulatie. Immunofluorescentietest voor de DSB markeringen γH2AX en 53BP-1 werd uitgevoerd. (A) scatter plot van genormaliseerde schade ROI fluorescentie intensiteiten gemeten voor onbeschadigde en beschadigde cellen betekenen. Foutbalken zijn representatief voor de SEM (n = 12). (B) de vertegenwoordiger beelden voor γH2AX en 53BP-1 kleuring. Pijlen geven aan waar micro-bestraling en de schaal bar is 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
Figuur 4. DNA dubbele strand break merkers krachtig reageren op 405 nm micro-bestraling. CHO-K1 cellen waren onderworpen aan micro-bestraling en vaste op het tijd punten aangegeven post stimuleren. Immunofluorescentietest voor de DSB markeringen γH2AX en 53BP-1. (A) scatter plot van genormaliseerde schade ROI fluorescentie intensiteiten gemeten voor onbeschadigde en beschadigde cellen betekenen. Foutbalken zijn representatief voor de SEM (n = 12). (B) de vertegenwoordiger beelden voor γH2AX en 53BP-1 kleuring. Pijlen geven aan waar micro-bestraling en de schaal bar is 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

De toepassing van 1% methyleenblauw kleurstof als een enkele techniek in borstkanker Sentinel knooppunt biopsie

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modellering van hersenmetastase door interne halsslagaderinjectie van kankercellen

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

Toepassing van AlDeSense om eierstokkankercellen te stratificeren op basis van aldehydedehydrogenase 1A1-activiteit

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...