Name: application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

המחברים רוצה להודות ד ר סמואל הנרי וילסון ב נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה עבור שורות תאים נעשה שימוש בעבודה זו.

המחברים אין לחשוף.

שימוש בתנאים המתוארים כאן, כל מיקרוסקופ קונפוקלי עם קרינת UV-A או 405 ננומטר לייזר, או משולב על ידי היצרן או נוספו על-ידי משתמש הקצה, באפשרותך לגרום נזק לדנ א בתוך גרעין התא ולאפשר הגיוס של חלבונים תיקון ה-DNA לאתר של המושרה נזק לדנ א כדי להיות במעקב. עם זאת, שכאמור פרוטוקול ותוצאות נציג, גל בחירה, חלה כוח, והיא נזק אפיון חשובים כל סוגיות שמחייבות תחילה על-ידי המשתמש כדי ללמוד על הדי. אן תיקון מסלול. בנוסף, ישנם שיקולים אחרים בהתווית גם להביא בחשבון על-ידי משתמשים.
כדי לעקוב אחר ההתנהגות של חלבון בפוסט תאים חיים מיקרו-הקרנה, חלבון fluorescently שכותרתו חייבים להיווצר. הזמינות של מגוון רחב של חלבונים פלורסנט כי ניתן להפריד spectrally מציע כלים ליצירת חלבון fusions יכול לשמש עבור אפיון הסלולר התגובות אינדוקציה של נזק לדנ א. תרביות תאים ארעית של חלבונים פלואורסצנט עניין מאפשר סינון מהיר של תנאים מזיק, מוטציות או אפילו מעכבי, תאים stably transfected מציעים יותר שליטה על רמות ביטוי ולאפשר אחרים הביוכימי אפיוני שיש לבצע, אימות מיקרו-הקרנה תוצאות. גם יכול להיות מנוצל חלבונים פלורסנט spectrally נפרדות באותו התא כדי לפקח על אינטראקציות בין חלבונים בתוך מסלול זהה או במשעולים שונים. חלבונים פלורסנט גם יבטל את הצורך של נוגדנים ספציפיים עבור כל חלבון עניין ומאפשרים לתא חי ניטור של חלבון התנהגות במשך פרקי זמן ארוכים לאחר תנאי הגיוס של נזק.
עם זאת, השימוש של חלבונים פלורסנט יש גם חסרונות. ללא רקע גנטי בנכונותם protein(s) של עניין, חלבונים אנדוגני יתחרו עם החלבונים fluorescently מתויגות. ההטיה של תג ניאון הסופית N או C של החלבון עשוי לשנות קיפול חלבונים, המעכבים אינטראקציות חלבון מפתח, או לחסום אותות רוברטסונית; שינוי פונקציה, שעלולים להשפיע על הדינמיקה גיוס. תופעות אלה הוכחו במספר דוחות איפה מכתים immunofluorescent הפגינו גיוס שונה באופן דרמטי ושעות השמירה חלבונים אנדוגני-אתר נזק28. השימוש של תרביות תאים ארעי או שיבוטים יציב יכול גם לשנות את התגובה שנצפו, בדרך כלל דרך בווריאציות רמות ביטוי החלבון. יתר על כן, השימוש של מספר חלבונים פלורסנט בניסוי יחיד יכול גם לשנות את הדינמיקה של גיוס, אם רמות החלבון לא equilibrated טוב או אם הגיוס של החלבון גדול מתויג fluorescently חוסם את הגיוס של חלבונים אחרים . בסופו של דבר, פלורסנט חלבונים יכולים לשמש סוכני רגישות עולה חלש, הגברת היווצרות של מינים חמצן תגובתי, פוטנציאל לשנות את ה-DNA נזק תערובות המושרה46,47. למרות חסרונות אלה חלבונים פלורסנט מציעים מספר יתרונות ברורים ב- DNA לומד לתקן עם מיקרו-הקרנה, אם משתמשים לשלב הפקדים המתאימים, כגון אפיון הנזק שתואר כאן, הם יכולים לספק תובנה חדשה לתוך נזק אינטראקציות חלבון-חלבון והיענות3.
אם התא חי הדמיה אינה נחוצה, immunofluorescence יכול לשמש כדי לנטר את התגובה המזורזת נזק. על ידי תיקון התאים במועדים ספציפיים פוסט נזק אינדוקציה והוא מכתים עם נוגדנים ספציפיים עבור חלבונים ונגעים של עניין, תמונות סטטיות של נזק אינדוקציה גיוס ושמירה של תיקון ניתן לבנות חלבונים. נוגדנים יכול לשמש כדי לפקח על הגיוס של חלבונים מרובים של ריבית ו/או שינויים post-translational המושרה על ידי התגובה נזק הדנ א. השימוש immunofluorescence מבטל את הצורך של חלבונים פלורסנט, ומאפשר חלבון אנדוגני התנהגות להיבדק. עם זאת, שיטה זו יש גם החסרונות. נוגדנים ספציפיים מאוד נחוצים, permeabilization ונהלים חסימה צריך להיות מותאם כדי לאפשר גילוי של גיוס עם עוצמת האות מספיקות. הליכי תיקון אינם נקודתית, ולא אילוץ פיזי זה מגביל את הרזולוציה הטמפורלי של גישה זו. מיפוי האתר של נזק אינדוקציה כך התאים שניתן למקם מחדש לאחר צביעת יכול להציג גם אתגרים משמעותיים. מיקרוסקופ קונפוקלי להשתמש בעבודה זו מאפשרת רישום מבוססת תמונה כפי שתוארה לעיל, אז יכול להיות ימוקמו מחדש תאים פגומים עם דיוק גבוהה. אם שלב רישום או חרוט coverglass אינה זמינה, הזמן ההשקעה מעורבים תאי המעבר ללא רישום הבמה, בשילוב עם עיכוב הטבועה בין נזק אינדוקציה ועל גיוס הדמיה, עלולה להפוך immunofluorescence אינה מושכת משתמשים מסוימים. עם זאת, הכי מדויקים ומלאים מיקרו-הקרנה ניסיוני העיצובים תשלב סוגים אלה של גישות במקביל עם השימוש של חלבונים פלורסנט, כמפורט בפרוטוקול שהוצגו.
כאן, הדמיה תא חי והן immunofluorescence משמש כדי להדגים את התועלת של לייזר מיקרו-הקרנה. צביעת immunofluorescent מאפשר לנו לבחון באופן מדויק את התערובת של נזק לדנ א נוצר ולפרש הגיוס של חלבונים המושרה על ידי כל כוח לייזר, אשר מאפשרים לנו טוב יותר השינויים שנצפו גיוס, השמירה של XRCC1-GFP. בהתבסס על תוצאות אלה, השימוש של 405 ננומטר לייזר צריכה להיות מוגבלת לבדיקה של חלבונים BER והן SSBR. עוד, הנבחנים אופטימלית כולל מדידות חשמל אחרי המטרה, אפיון תערובת נזק מלא עבור כל קו תא בשימוש וכן אימות של הגיוס ו שמירה שנצפתה fluorescently מתויג חלבונים עם immunofluorescence. ללא ספק, ציוד, זמן, שיקולי עלות עלולה להפוך אלה עיצובים מוטוריים אופטימלי אפשרי עבור משתמשים מסוימים. עם זאת, החשיבות של כל אחד מהרכיבים הללו הוכח כאן ולאחר משתמשים יש לזכור שיקולים אלו לאחר תחילת הניסויים מיקרו-הקרנה.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי התפתחה טכניקה חזקה כדי להמחיש אדריכלות הסלולר, לבדוק חלבון לוקליזציה לפקח על אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-DNA. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללמוד DNA נזק תגובות לאחר היישום של DNA הכללית פגיעה סוכנים, כגון אור אולטרה סגול (UV), קרינה מייננת, חמצון כימי או סוכנים החומר, ו/או chemotherapeutics סיפקה תובנה חדשה החניכה, איתות, גיוס של ה-DNA לתקן חלבונים לאתרים של ה-DNA נזק1,2. עם זאת, אלה הכללית ואסינכרוניות פגיעה אירועים המגבילים, אם מפורט מידע על צו גיוס, קינטיקה של העמותה או דיסוציאציה, קשרי הגומלין בין חלבונים תיקון ה-DNA מפתח מתבקשות. למרבה המזל, החידושים סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר, זמינות רחבה יותר של גרימת נזק אורכי גל לייזר, ושיפורים בחלבונים פלורסנט ב 25 השנים האחרונות סיפקו לחוקרים בכלים משופרים לבחינת אלה היבטים של ה-DNA תיקון, דרך אינדוקציה נזק ממוקד של DNA.
הקרנה של תאים עם לייזר microbeams ללימוד סלולרית ו- subcellular הוא כלי ומבוססת ביולוגיה של התא והקרנות -3. היישום של טכניקה זו לחקר DNA לתקן בקע כאשר קרמר ועמיתים אולטרה מאוד ממוקד (257 ננומטר) לייזר מערכת microbeam לגרום נזק לדנ א מעל במקום שחלה אוגר סיני (CHO) 0.5 מיקרומטר תאים4 והקימו את אינדוקציה של Photolesions ה-DNA על ידי זה מערכת5. בעוד מציע שיפורים משמעותיים על פני שיטות microbeam UV בזמנו, אימוץ זה גרימת נזק למערכת הייתה מוגבלת בשל הגדר המקצועית שלו, ואת יכולתו ליצור גדיל כפול מעברי (DSBs)6. בהמשך החקירה מגוון רחב של UV-B (290-320 ננומטר) ו UV-אורכי גל (320-400 ננומטר) על ידי מספר קבוצות חשף כי photoproducts UV, חמצוני לבסס נגעים, לחוט אחד שובר (SSBs), DSBs יכולים להיגרם תלויים אורך הגל של הלייזר ו כוח להחיל4,7,8,9,10 (נבדקה ב 3). יתר על כן, שילובים של אלה UV-B, אורכי גל של קרינת UV-A עם sensitizing סוכנים, כמו פסוראלן, bromodeoxyuridine (BrdU), צבעי Hoechst, נמצאו גם כדי לגרום נזק לדנ א תלויה באורך הגל, כוח ומשך החשיפה, למרות הכוח הדרוש כדי לגרום נזק לעיתים קרובות נפגמת בנוכחות סוכנים11,12,13,14,15. הפיתוחים האלה הרחיבה את השימוש מיקרו-הקרנה, למרות שלא היו מכשולים טכניים עדיין יש לטפל עבור אימוץ נרחב יותר של שיטות אלה.
קרמר ועמיתים לעבודה משמעותית מתקדמות בתחום מיקרו-הקרנה על ידי התמקדות בדיוק את microbeam UV כדי להחיל אנרגיה נזק משמעותי על פני שטח מאוד המותאמות לשפות אחרות בתא. כמו מיקרוסקופ קונפוקלי ומערכות microdissection לייזר מתקדם, אור ממוקד בחוזקה היה להפכה נגיש; עם זאת, צימוד מקורות UV כדי טווחי והתמודדות עם סטיות כרומטי שהם המושרה עדיין הציג אתגרים משמעותיים רוב המשתמשים3,6,16. כמו צבעי לכה UV גדל הפופולריות במהלך שנות ה-90, אופטיקה מסוגל להתמקד פלורסצנטיות UV-נלהב לכידת הפך זמין נרחב יותר16ואת שיפורים סריקת לייזר מוצעים למשתמשים היכולת ליצור מאוד ממוקד UV עירור כתמים בתוך תאים6,17. עם זאת, זה לא היה עד בתחילת שנות האלפיים כי ההשפעה האמיתית של שילוב זה של קורות ממוקד באופן הדוק עם לייזר בעוצמה גבוהה יותר הורגשה, כאשר דיווחים רבים יצאו להפגין מעברי גדיל DNA יכולים להיגרם עם ובלי לרגישות ב קרינת UV-A טווח6,10,18,19,20, 405 ננומטר21,22,23,24, 25,26, ו אפילו באורכי גל כבר גלוי כמו 488 ננומטר27. הפיתוחים האלה המותר עבור אימוץ נרחב יותר של טכניקת מיקרו-הקרנה על מספר מערכות מסחריות. במקביל, עם התפתחויות אלה, טכניקות שני הפוטונים גם בקע שמותר אינדוקציה מדויק של נזק לדנ א; למרות הפיתוחים האלה לא יידונו כאן, ישנם מספר מאמרים סקירה דנים אלה מתודולוגיות9,28,29,30.
עם הנגישות הנוכחי של מיקרוסקופ קונפוקלי מסוגל לספק אור UV מאוד ממוקד וזמינות פרושות לרווחה של חלבונים פלורסנט כדי לאפשר מעקב בזמן אמת אחר חלבונים תיקון ה-DNA, התפתחו טכניקות מיקרו-הקרנה כלים רבי-עוצמה לבחינת ה-DNA נזק התגובה ותיקון מסלולים. עם זאת, משתמשים צריכים להיות מודעים כי הדור של נזק לדנ א תלויה מאוד את אורך הגל של הלייזר ואת הכוח חלה על אזור תת גרעינית. השימוש UV-C (~ 260 ננומטר) אורכי הגל אפשר עירור DNA ישיר של סלקטיביות גבוהה עבור אינדוקציה של UV-photoproducts-7,-8. UV-B ו- UV-A אורכי גל לייצר תערובות של נזק לדנ א (בסיס הנגע, SSBs ו DSBs), התלוי על הכוח יישומית ואת הרקע הסלולר מנוצל7. Photosensitizers אנדוגני ורמות החמצון בתאים יישוב יכול להשפיע על תערובות נזק DNA המיוצר על ידי אורכי גל אלה. בנוסף, השימוש photosensitizers אקסוגני (BrdU, וכו ') עשוי לסייע בהורדת את האנרגיה הדרושה של אינדוקציה של נזק לדנ א. עם זאת, הסוכנים האלה יכול לגרום נזק לדנ א בכוחות עצמם, הם עשוי לשנות את מחזור התא ואת הכרומטין, אז השימוש שלהם עשויה לייצר תופעות לוואי צריך להיחשב על ידי המשתמש. לכן, לפני השימוש מיקרו-הקרנה ללמוד DNA נזק התגובה ותיקון, שיקול דעת זהיר של הנתיב תיקון ה-DNA של הריבית, זמינים לשימוש אורכי הגל התערובת נזק DNA נוצר נדרש.
כאן, לייזר מיקרו-הקרנה מבוצעת באורכי גל שני נפוץ, 355 nm ו 405 ננומטר, בלי לרגישות להפגין את תערובות של נזק לדנ א המושרה על ידי אורכי גל אלה ואת ההשפעות האלה תערובות נזק יש על בחינת התיקוןSSBs, DSBs. משתמשים צריכים להיות מודעים לכך אורכי גל אלה אינם יוצרים זן אחד של מעברי חוט או נגעים הבסיס. כדי להפלות בין ה-DNA שמסלולי התיקון, משתמשים חייבים לשלוט בכוח שהוחלו על אזור מסוים של הגרעין ובזהירות לאפיין את הנזק המושרה באמצעות מספר strand break סמני DNA הנגע נוגדנים. אם כראוי מוחל, מאופיין לייזר מיקרו-הקרנה יכול להעשיר מינים מסוימים של נזק לדנ א, מתן אפשרות למשתמשים להעריך את התיקון של נגעים הבסיס, SSBs או DSBs, עם קצת ירידה לפרטים. לכן, סיפקנו שיטה המאפשרת למשתמשים reproducibly לבצע מיקרו לייזר-הקרנה, לאפיין את תערובות DNA נזק הנגרם על ידי המינון לייזר יישומית, לבצע ניתוח נתונים.

<table style="border-collapse:collapse;width:548pt" width="730">
	<colgroup>
		<col style="width:220pt" width="293" />
		<col style="width:119pt" width="158" />
		<col style="width:84pt" width="112" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">NIS Elements software</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">355 nm laser</td>
			<td class="xl23">PicoQuant VisUV</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Galvanometer photoactivation miniscanner</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Bruker</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Microscope slide photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S170C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fiber photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S150C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Digital handheld optical power and energy meter</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">PM100D</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">CHO-K1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158"></td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Minimal essential media</td>
			<td class="xl28">Hyclone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">SH3026501</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fetal bovine serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Atlanta biologicals</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S11550</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">XRCC1-GFP</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Origene</td>
			<td class="xl27">RG204952</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Jetprime</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Polyplus transfection</td>
			<td class="xl27">11407</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Geneticin</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl27">10131035</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155382</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">8 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155409</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 53BP-1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Novus</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">NB100304</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti-phospho-histone H2AX&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Millipore</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">05-636-I</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti cyclobutane pyrimidine dimer</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Cosmo Bio clone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">CAC-NM-DND-001</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 8-oxo-2&#180;-deoxyguanosine&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Trevigen</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">4354-MC-050</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 488 goat anti-mouse</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11029</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 546 goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11010</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">R37606</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Phosphate buffered saline</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">0780</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Normal goat serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">31873</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Jackson Immuno Research</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">001-000-162</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">37% Formaldehyde</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">9311</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Ethanol</td>
			<td class="xl20">Decon Labs</td>
			<td class="xl20">2716</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Methanol</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">VWR</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">BDH1135</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">HCl</td>
			<td class="xl20">Fisher</td>
			<td class="xl20">SA49</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Sodium azide</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:84pt" width="112">S2002</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Tris Hydrochloride</td>
			<td class="xl20">Amresco</td>
			<td class="xl20">O234</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Triton X-100</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">T8787</td>
			<td class="xl29"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells

מאוד מתואמת שמסלולי התיקון ה-DNA קיימים לזהות, בלו להחליף פגום DNA בסיסים ושל לתאם תיקון של מעברי גדיל ה-DNA. בעוד שיטות בביולוגיה מולקולרית הבהירו מבנה אנזימטי פונקציות, קינטיקה של תיקון חלבונים, יש עדיין צורך להבין כיצד תיקון הוא מתואם בתוך הגרעין. לייזר מיקרו-הקרנה מציע כלי רב עוצמה עבור גרימת נזק לדנ א וניטור הגיוס של תיקון חלבונים. אינדוקציה של ה-DNA נזק על ידי לייזר מיקרו-הקרנה יכולה להתרחש במגוון של אורכי גל, משתמשים יכול לגרום באופן אמין מעברי לחוט אחד, נגעים הבסיס כפול סטרנד מעברי עם מגוון של מנות. כאן, לייזר מיקרו-הקרנה משמש כדי לבדוק התיקון של יחיד, כפול סטרנד מעברי המושרה על ידי אורכי גל לייזר קונפוקלי נפוצים שני, 355 nm ו 405 ננומטר. אפיון נוסף, כמו שצריך המינון לייזר שימושית עבור גרימת נזק ספציפי תערובות מתואר, כך משתמשים יכולים לבצע reproducibly לייזר מיקרו-הקרנה והקפאה וניתוח.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells at JoVE.com

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

היישום של 1% מתילן צבען כחול כטכניקה אחת בסרטן השד הזקיף צומת ביופסיה

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescence הדמיה של נזק לדנ א ותיקון Foci בתאי סרטן המעי הגס האנושי

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

מידול גרורות במוח על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי של תאים סרטניים

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בעכברים משחזרת סרטן מעי גס מתקדם

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

יישום AlDeSense לריבוד תאי סרטן השחלות על בסיס פעילות אלדהיד דהידרוגנאז 1A1

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...