Name: application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00
Duration: 8 min 18 s
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Os autores gostaria de agradecer ao Dr. Samuel H. Wilson no nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental para a linha de celular utilizada neste trabalho.

Os autores não têm nada para divulgar.

Usando as condições descritas aqui, qualquer microscópio confocal com uma UV-A ou 405 nm laser, integrado pelo fabricante ou adicionados pelo usuário final, pode induzir a danos no DNA dentro do núcleo de uma célula e permitir o recrutamento de proteínas de reparo do DNA para o site da induzida por dano do ADN a ser monitorado. No entanto, conforme indicado no protocolo e resultados representativos, seleção do comprimento de onda, aplicado o poder, e caracterização de danos são todos importantes questões que devem ser abordadas primeiro pelo usuário a fim de estudar um DNA específico reparar o caminho. Além disso, existem outras considerações no delineamento experimental que também deve ser considerado pelos usuários.
Para monitorar o comportamento de uma proteína em células vivas post microirradiação, uma proteína fluorescente etiquetada deve ser criada. A disponibilidade de uma vasta gama de proteínas fluorescentes que podem ser separadas espectralmente oferece ferramentas para criar fusões de proteína que podem ser usados para caracterizar respostas celulares para a indução de dano do ADN. Transfection transiente de proteínas fluorescentes de interesse permite a seleção rápida de condições prejudiciais, mutações ou até mesmo inibidores, enquanto células transfectadas estàvel oferecem mais controle sobre os níveis de expressão e permitir a outros bioquímicos caracterizações para ser executada, validação de resultados de microirradiação. Proteínas fluorescentes espectralmente distintas também podem ser utilizadas na mesma cela para monitorar as interações entre proteínas dentro da mesma via ou em caminhos diferentes. Proteínas fluorescentes também eliminam a necessidade de anticorpos específicos para cada proteína de interesse e permitir que a célula viva, monitoramento do comportamento de proteína por longos períodos de tempo após a indução de danos.
No entanto, o uso de proteínas fluorescentes também tem desvantagens. Sem origens genéticas deficientes nas somáticas de interesse, proteínas endógenas vão competir com as proteínas fluorescente etiquetadas. Conjugação da marca para o terminus N ou C da proteína fluorescente pode alterar o enrolamento de proteínas, impedir interações proteína-proteína-chave ou bloquear os sinais da translocação; alterar a função e potencialmente afetar a dinâmica de recrutamento. Estes efeitos foram demonstrados em uma série de relatórios onde coloração imunofluorescente demonstrou recrutamento dramaticamente diferente e tempos de retenção para proteínas endógenas no dano local28. Uso de transfecção transiente ou clones estáveis também pode alterar a resposta observada, normalmente através de variações nos níveis de expressão de proteínas. Além disso, o uso de proteínas fluorescentes múltiplas em uma única experiência pode também alterar a dinâmica de recrutamento, se os níveis de proteína não são incubados bem ou se o recrutamento da proteína fluorescente-com a tag maior bloqueia o recrutamento de outras proteínas . Finalmente, proteínas fluorescentes podem atuar como agentes de sensibilização fraca, aumentando a formação de espécies reactivas de oxigénio e potencialmente alterando o DNA danos misturas induzido46,47. Apesar destas deficiências, proteínas fluorescentes oferecem uma série de vantagens em estudar DNA reparar com microirradiação, e se os usuários incorporar controles apropriados, tais como a caracterização de dano aqui descritas, podem fornecer uma nova visão em danos resposta e da proteína-proteína interações3.
Se a imagem de célula viva não é necessária, imunofluorescência pode ser usada para monitorar a resposta aos danos induzidos. Fixação de células em alturas específicas pós indução de danos e coloração com anticorpos específicos para proteínas e lesões de interesse, instantâneos estáticos de indução de danos e o recrutamento e retenção de proteínas podem ser construídas de reparação. Anticorpos podem ser usados para monitorar o recrutamento de várias proteínas de interesse e/ou modificações borne-translational induzidas pela resposta de dano do ADN. Uso da imunofluorescência elimina a necessidade de proteínas fluorescentes e permite o comportamento de proteína endógena ser examinado. No entanto, esse método também tem suas desvantagens. Anticorpos altamente específicos são necessários, e permeabilização e bloqueio procedimentos precisam ser otimizados para permitir detecção de recrutamento com intensidade de sinal suficiente. Procedimentos de fixação não são instantâneos, e essa restrição física limita a resolução temporal desta abordagem. O site da indução de danos de mapeamento para que as células podem ser re-localizadas depois da coloração, também pode apresentar desafios significativos. O microscópio confocal usado neste trabalho permite registro baseado em imagem conforme descrito acima, para que as células danificadas podem ser realocadas com alta precisão. Se registro de palco ou lamela gravada não estiver disponível, o tempo de investimento envolvido em células realocando sem registro de estágio, juntamente com o atraso inerente entre a indução de danos e o recrutamento de imagem, podem fazer imunofluorescência atraente para alguns usuários. No entanto, os projetos experimentais microirradiação mais exacto e completos irão incorporar estes tipos de abordagens em paralelo com o uso de proteínas fluorescentes, conforme descrito no protocolo apresentado.
Aqui, tanto a imagem de célula viva e a imunofluorescência é usado para demonstrar a utilidade do microirradiação do laser. A coloração imunofluorescente nos permite analisar com precisão a mistura de dano do ADN criado e o recrutamento de proteínas induzidas por cada poder do laser, que nos permitem melhor interpretar as alterações observadas no recrutamento e retenção de XRCC1-GFP. Com base nestes resultados, o uso de 405 nm lasers deve ser limitado para exame de BER e SSBR proteínas. Além disso, o delineamento ideal incluiria as medições de energia após o objetivo, uma caracterização de mistura de danos completo para cada linha de celular usada e validação do recrutamento e retenção observada em fluorescente etiquetado proteínas com imunofluorescência. Obviamente, considerações de custo, tempo e equipamentos podem fazer estes desenhos experimentais ideais impossível para alguns usuários. No entanto, a importância de cada um desses elementos é demonstrada aqui, e os usuários devem ter estas considerações em mente ao iniciar experiências de microirradiação.

Microscopia fluorescente tem emergido como uma técnica poderosa para visualizar a arquitetura celular, examinar a localização da proteína e monitorar as interações da proteína-proteína e proteína-ADN. Usando microscopia fluorescente para estudar respostas de dano de DNA após a aplicação do DNA global agentes nocivos, como luz ultravioleta (UV), radiação ionizante, oxidantes químicos ou agentes alquilantes, e/ou chemotherapeutics tem proporcionado a introspecção nova a iniciação, sinalização e recrutamento de DNA reparar proteínas para sites de DNA danos1,2. No entanto, estes global e assíncrono danificar eventos estão limitando, se informações detalhadas sobre a ordem de recrutamento, cinética da associação ou dissociação, e as relações entre as principais proteínas de reparo de DNA são procuradas. Felizmente, os avanços na exploração microscópios confocal do laser, mais ampla disponibilidade de comprimentos de onda do laser danos de indução e melhorias em proteínas fluorescentes nos últimos 25 anos forneceram pesquisadores com ferramentas melhoradas para examinar estas reparação de aspectos do DNA, através da indução de dano de DNA alvo.
Irradiação de células com laser microbeams fim de estudar as funções celulares e subcelulares é uma ferramenta bem estabelecida na célula e radiação de biologia3. Aplicação desta técnica para o estudo da reparação do DNA surgiu quando Cremer e colegas de trabalho usaram um UV altamente focada (257 nm) sistema de microbeam laser para induzir dano do ADN sobre um 0,5 µm em ovário de hamster chinês (CHO) local células4 e estabeleceu a indução de DNA photolesions por este sistema5. Enquanto oferecer melhorias significativas sobre os métodos de UV microbeam aquando da adopção da presente, danificando o sistema foi limitada devido à sua criação especializada e sua incapacidade de gerar dupla vertente quebra (DSBs)6. Investigações subsequentes de uma variedade de UV-B (290-320 nm) e UV-um comprimento de onda (320-400 nm) por um número de grupos revelou que photoproducts UV, oxidativos baseiam lesões, único filamento rompe (SSBs) e DSBs poderiam ser induzidas depende do comprimento de onda do laser e energia aplicada4,7,8,9,10 (revisto em 3). Além disso, combinações destes UV-B e UV-A comprimentos de onda com sensibilizante de agentes, como o psoraleno, bromodeoxyuridine (BrdU) e Hoechst corantes, também foram encontradas para induzir dano de DNA dependente de comprimento de onda, potência e duração da exposição, embora o poder necessário para induzir o dano é muitas vezes reduzido na presença destes agentes11,12,13,14,15. Esses avanços expandiu o uso de microirradiação, embora houvesse obstáculos técnicos ainda de ser abordada por uma maior adopção desses métodos.
Cremer e colegas de trabalho avançaram significativamente o campo de irradiação de micro centrando-se precisamente o microbeam UV para aplicar energia prejudicial significativas ao longo de uma área altamente localizada na célula. Como microscópios confocal e sistemas de laser microdissection avançaram, luz firmemente focalizada foi mais amplamente acessível; no entanto, fontes UV de acoplamento para escopos e lidar com as aberrações cromáticas, que eles induziram ainda apresentaram um desafio significativo para a maioria dos usuários3,6,16. Como tintas UV aumentaram em popularidade durante a década de 1990, óptica capaz de se concentrar e captura de fluorescência UV-animado tornou-se mais amplamente disponível16, e melhorias na exploração do laser ofereceram aos usuários a capacidade de criar altamente focada UV pontos de excitação dentro células6,17. No entanto, não foi até o início dos anos 2000 que o verdadeiro impacto desta combinação de feixes firmemente focalizadas com lasers de intensidade mais elevadas foi sentido, quando inúmeros relatos emergiram demonstrando que quebras da cadeia de DNA poderiam ser induzidas com e sem sensitizers na UV-A gama6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,,26e até mesmo a mais visíveis comprimentos de onda como 488 nm27. Esses avanços permitidos para mais ampla adoção da técnica da microirradiação em um número de sistemas comerciais. Paralelamente a estes desenvolvimentos, técnicas de dois fotões também emergiram que permitiu precisa indução de dano do ADN; Embora esses avanços não serão discutidos aqui, há um número de artigos de revisão, discutindo essas metodologias9,28,29,30.
Com a acessibilidade atual de microscópios confocal capazes de proporcionar altamente focalizado de luz UV e a disponibilidade generalizada de proteínas fluorescentes para permitir o acompanhamento em tempo real das proteínas de reparo do DNA, técnicas de microirradiação têm evoluído para ferramentas poderosas para examinar caminhos de resposta e a reparação de danos de DNA. No entanto, os usuários precisam estar cientes de que a geração de dano do ADN é altamente dependente do comprimento de onda do laser e a energia aplicada à região sub nuclear. Uso de UV-C (~ 260 nm) comprimentos de onda permitem excitação direta de DNA e alta seletividade para a indução de UV photoproducts7,8. UV-B e UV-A comprimentos de onda produzem misturas de dano do ADN (lesão de base, SSBs e DSBs), dependente da energia aplicada e o fundo celular utilizada7. Fotossensibilizadores endógenas e níveis de antioxidante nas células alvo podem influenciar as misturas de dano de DNA produzidas por estes comprimentos de onda. Além disso, o uso de fotossensibilizadores exógenos (BrdU, etc.) pode ser úteis em reduzir a energia necessária para a indução de dano do ADN. No entanto, esses agentes podem induzir dano do ADN por si mesmos, e eles podem alterar o ciclo celular e a estrutura da cromatina, assim que seu uso pode produzir efeitos indesejados que precisam ser consideradas pelo usuário. Portanto, antes de usar o microirradiação para estudar reparação e resposta de dano do ADN, consideração cuidadosa da via de reparo de DNA de interesse, os comprimentos de onda disponíveis para uso e a mistura de dano de DNA criado é necessária.
Aqui, o microirradiação do laser é realizada em dois comprimentos de onda usados, 355 nm e 405 nm, sem sensitizers para demonstrar as misturas de danos no DNA induzidos por estes comprimentos de onda e as influências dessas misturas de danos têm em examinar a reparação deSSBs e DSBs. os usuários devem estar cientes de que estes comprimentos de onda não criar uma única espécie de quebras ou lesões de base. Para discriminar entre vias de reparo do DNA, usuários cuidadosamente deverá controlar a força aplicada sobre uma região específica do núcleo e caracterizar o dano induzido usando vários marcadores de quebra de fio e anticorpos de lesão do DNA. Se adequadamente aplicada e caracterizada, microirradiação do laser pode enriquecer algumas espécies de dano do ADN, que permite aos usuários avaliar o reparo de lesões de base e SSBs ou DSBs, com alguma especificidade. Portanto, nós fornecemos um método que permite aos usuários executar microirradiação do laser reproducibly, caracterizar as misturas de dano do DNA induzidas pela dose aplicada do laser e realizar a análise de dados.

<table style="border-collapse:collapse;width:548pt" width="730">
	<colgroup>
		<col style="width:220pt" width="293" />
		<col style="width:119pt" width="158" />
		<col style="width:84pt" width="112" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">NIS Elements software</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Nikon</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">355 nm laser</td>
			<td class="xl23">PicoQuant VisUV</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">Radiation source</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Galvanometer photoactivation miniscanner</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Bruker</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Microscope slide photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S170C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fiber photodiode power sensor</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S150C</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Digital handheld optical power and energy meter</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">THORLabs</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">PM100D</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">CHO-K1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158"></td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112"></td>
			<td class="xl23">From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Minimal essential media</td>
			<td class="xl28">Hyclone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">SH3026501</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Fetal bovine serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Atlanta biologicals</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">S11550</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">XRCC1-GFP</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Origene</td>
			<td class="xl27">RG204952</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Jetprime</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Polyplus transfection</td>
			<td class="xl27">11407</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Geneticin</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl27">10131035</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155382</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">8 chambered coverglass</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">155409</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 53BP-1</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Novus</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">NB100304</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti-phospho-histone H2AX&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Millipore</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">05-636-I</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti cyclobutane pyrimidine dimer</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Cosmo Bio clone</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">CAC-NM-DND-001</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Anti 8-oxo-2&#180;-deoxyguanosine&#160;</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Trevigen</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">4354-MC-050</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 488 goat anti-mouse</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11029</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Alexa 546 goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">A11010</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">4&#8217;,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">R37606</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Phosphate buffered saline</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">0780</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Normal goat serum</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">31873</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Jackson Immuno Research</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">001-000-162</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">37% Formaldehyde</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">ThermoFisher</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">9311</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Ethanol</td>
			<td class="xl20">Decon Labs</td>
			<td class="xl20">2716</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Methanol</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">VWR</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">BDH1135</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">HCl</td>
			<td class="xl20">Fisher</td>
			<td class="xl20">SA49</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Sodium azide</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl18" style="width:84pt" width="112">S2002</td>
			<td class="xl23">Caution toxic!</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Tris Hydrochloride</td>
			<td class="xl20">Amresco</td>
			<td class="xl20">O234</td>
			<td class="xl23"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:220pt;height:15.75pt" width="293">Triton X-100</td>
			<td class="xl21" style="width:119pt" width="158">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl21" style="width:84pt" width="112">T8787</td>
			<td class="xl29"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of laser micro-irradiation for examination of single and double strand break repair in mammalian cells

Vias de reparo de DNA altamente coordenadas existem para detectar, impostos especiais de consumo e substituir as bases de DNA danificadas e coordenar a reparação de quebras da cadeia de DNA. Enquanto as técnicas de biologia molecular clarificaram a estrutura, funções enzimáticas e cinética de proteínas de reparo, ainda há uma necessidade de compreender como o reparo é coordenado dentro do núcleo. Microirradiação do laser oferece uma poderosa ferramenta para indução de dano do ADN e o recrutamento de proteínas de reparo de monitoramento. Indução de dano do ADN por microirradiação do laser pode ocorrer com uma gama de comprimentos de onda, e os usuários confiável podem induzir quebras da cadeia única, base lesões e quebras da cadeia dupla com uma gama de doses. Aqui, microirradiação do laser é usado para examinar o reparo de single e double quebras induzidas por dois comum do laser confocal comprimentos de onda, 355 nm e 405 nm. Além disso, a adequada caracterização da dose do laser aplicado por indução de misturas de dano específico é descrita, assim os usuários podem reproducibly executar análise e aquisição de dados de microirradiação do laser.

Caracterização de danos no DNA induzidos Indução de lesões de base e quebras é dependente da dose do laser aplicada à área selecionada nuclear e o microambiente celular do modelo celular usado7. Proteínas fluorescentes fundidas para reparar as proteínas, como XRCC1, 53BP1, Ku70 ou Rad51, fornecer úteis single e double vertente marcadores de intervalo para estabelecer a energia mínima necessária para ver o acúmulo de uma proteína fluorescente dentro um dano ROI acima o fluorescência do fundo9,19,31. Uma vez que encontram-se as condições que induzem uma resposta, é fundamental para caracterizar a mistura de danos induzida por esse comprimento de onda específico e a dose. Atenuação da dose e duração no comprimento de onda usado pode permitir que o usuário minimizar a formação de misturas complexas de danos. Doses baixas do laser na faixa do UV-A tem demonstrados para produzir predominantemente SSBs e uma pequena quantidade de base lesões, apropriadas para estudar SSBR e BER vias10,28. Aumentando a dose cria lesões de base mais complexas, oxidativas e UV induzida e induz a um número mais significativo de DSBs7,10. Enquanto a indução de uma única espécie de dano do ADN é desejável para exame das vias de reparo de DNA específicas, é mais provável que os usuários estão induzindo uma mistura de lesões do DNA, com uma lesão específica como SSBs, sendo muito mais frequentes do que as lesões de base ou DSBs. Isso é semelhante às misturas de dano do DNA induzidas por agentes químicos, como o peróxido de hidrogênio (H2O2) ou metil Metanossulfonato (MMS)32. Os usuários precisam estar ciente de quando eles relatam resultados que danificam as misturas podem ocorrer e caracterização cuidadosa da dose e lesões no local do dano induzido são necessárias para assegurar a reprodutibilidade e a comparabilidade dos seus resultados.
Em estudos de microirradiação, XRCC1-GFP é muitas vezes usado como um marcador para a indução de lesões de base e SSBs9,28. XRCC1 é uma proteína de andaime que desempenha um papel importante na reparação SSB (SSBR) e excisão base reparar (BER) e também participa de outras vias de reparação, como nucleotídeos excisão reparação (NER)33,34,35 . Que desempenha um importante papel de coordenação na reparação do ADN, interagindo com um número de proteínas chaves, incluindo poly(ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1), DNA polimerase β (Pol β) e DNA ligase III. Utilizamos o XRCC1-GFP estàvel expressado em células CHO-K1 para determinar as doses do laser necessárias para gerar SSBs e DSBs. Primeiro identificamos a dose mínima necessária para induzir um recrutamento observável de XRCC1-GFP para cada comprimento de onda (Figura 1). Para a 355 nm comprimento de onda uma 2 tempo de interrupção de s sobre o dano definido ROI gerado um aumento sinal fluorescente dentro o ROI, indicando a indução de dano do ADN que era detectável sobre o fundo (Figura 1A). Para 405 nm, uma taxa de varredura de 8 fps era necessária para gerar um recrutamento observável ao dano ROI (Figura 1A). A dose foi então aumentada (10 s para 355 nm e 0,5 fps para 405 nm) para criar um mais intenso danificar ROI (Figura 1A).
Recrutamento e retenção de XRCC1-GFP no local do dano induzido então foi monitorada por imagens de timelapse. Retenção da proteína no local do dano ao DNA pode indicar reparo de ADN em curso, enquanto a dissociação das proteínas no site do dano induzido é muitas vezes considerada um marcador para conclusão de BER ou SSBR. No entanto, não houve nenhuma evidência clara vinculação a dissociação de XRCC1 de sites de dano de DNA induzida por laser, com a conclusão da reparação. Recrutamento da proteína para o local do dano é medido através do relato da intensidade média do sinal fluorescente dentro o ROI danificado sobre o sinal fluorescente médio medido para o núcleo inteiro (Figura 1B). Este tipo de normalização ajuda flutuações de intensidade endereço no sinal nuclear, embora outras técnicas de normalização podem ser empregadas dependendo da distribuição celular da proteína de interesse. Aqui, XRCC1 está localizada no compartimento nuclear, então medidas de normalização para a área nuclear a redistribuição do sinal para os danos ROI. A intensidade fluorescente média de ROI então é gravada para cada imagem em timelapse, incluindo a imagem pré-dano e graficamente em função do tempo (Figura 1C).
Então nós ainda mais caracterizado o dano induzido pelas duas doses de selecionados do laser para examinar a formação de lesões de base de DNA. Em primeiro lugar, a formação de CPD, uma volumosa lesão induzida por UV, foi sondada por imunofluorescência como um marcador para lesões do tipo NER(Figura 2). Em seguida, o lesion8-oxodG base oxidativamente induzida foi sondada como um marcador para lesões do tipo BER (Figura 2B). Nenhum aumento significativo nas lesões CPD foram observadas para a exposição de baixa dose para dois comprimentos de onda (2 s para 355 nm e fps 8 para 405 nm), enquanto a alta dose de tratamento em ambos os comprimentos de onda (10 s para 355 nm e 0,5 fps para 405 nm) mostraram um aumento significativo no fluorescente sinal observado dentro os danos ROI(Figura 2). Um gráfico de dispersão do CPD ROI significa intensidade para cada célula danificada mostra heterogeneidade na formação de danos e deteção em ambos os comprimentos de onda e doses, indicando que um baixo nível de lesões CPD pode estar presente nas doses mais baixas, mas a carga não pode ser significativamente detectadas até uma dose maior é aplicada. O gráfico de dispersão sugere também a ineficiência na pesquisa de anticorpos que possam limitar a quantificação exata das misturas danos.
Isto é ainda mais realçado na detecção de lesões de DNA oxidativamente induzidas pelo marcador 8-oxodG. Nenhum claro aumento sinal fluorescente dentro os danos ROI foi observado para 8-oxodG em comprimento de onda do laser ou dose utilizada (Figura 2B). O anticorpo usado para este trabalho é consistente com as anteriores Publicações9,10,36; no entanto, deve notar-se que pode haver limitações em observar a formação de 8-oxodG com anticorpos37,38. Também é recomendada para confirmação da ausência de lesões oxidativamente induzidas por um segundo marcador, como o recrutamento de 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), a enzima responsável pela remoção de 8-oxodG do DNA de10. Não observamos OGG1 recrutamento aos nossos sites de dano do ADN; no entanto, a formação de baixos níveis de dano do ADN oxidativamente induzido não pode ser descartada completamente.
Finalmente, examinamos a formação de DSBs usando dois marcadores, γH2AX e 53BP-1, no selectedoses de d do laser por imunofluorescência (Figura 3 &#38; 4). ΓH2AX é comumente usado como um marcador de quebra de fio, mas sua especificidade para DSBs tem sido questionada em um número de relatórios39,40. Além disso, é um evento de fosforilação que propaga-se do local de descanso do vertente, para que localização do sinal de uma ruptura do fio possa ser limitada devido a essa propagação do sinal. Portanto, combinar γH2AX com 53BP-1 permite uma avaliação mais precisa da formação de ORL dentro os danos ROI.
A resposta do γH2AX e 53BP-1 a microirradiação é comprimento de onda e dose dependente. A dose baixa (2 s) estimulação em 355 nm não provoca nenhuma resposta às 5 e 20 min e uma irradiação post 10 min fraco e variável resposta(Figura 3)para ambos os marcadores. A dose elevada (10 s) 355 nm microirradiação induz um aumento sinal fluorescente dentro os danos ROI em 5, 10 e 20 min pós irradiação que é reduzida em 40 min (Figura 3B). Estes resultados indicam que cuidado a titulação da dose 355 nm é necessário para minimizar a Cruz-estimulação das vias de reparação, como demonstrado pela reduzida detecção da dupla vertente pausa marcador γH2AX nos pontos de tempo de início (&#60; 20 min) com a dose baixa aplicado.
Experiências semelhantes foram realizadas usando baixa (8 fps) e alta dose (0,5 fps) 405 nm laser estimulação (Figura 4). Neste comprimento de onda observou-se significativa acumulação de intensidade fluorescente dentro os danos ROI para 53BP-1 e γH2AX, independentemente da dose aplicada, indicando que essas doses gerará uma mistura complexa de quebras simples e duplas quase imediata após a indução de dano do ADN (Figura 4). Além disso, as altas doses de show de 405 nm um aumento na coloração de γH2AX pan-nuclear dentro de 10 min de indução de danos (Figura 4B, inferior) que dificulta a deteção dos danos ROI ao relatório, enquanto o acúmulo de 53BP-1 é mais contidos os danos ROI.
Estes resultados demonstram claramente que a 405 nm microirradiação não é apropriado para monitoramento SSBR ou BER, e que vários marcadores de DNA adutos e vertente quebras deve ser empregado para caracterizar completamente as lesões induzidas e respostas de reparação do DNA.
Alteração de dose-dependente no recrutamento e retenção de XRCC1-GFP Uma vez que o dano ao DNA induzido tem sido caracterizado, microirradiação do laser pode ser uma plataforma ideal para estudar a dinâmica das proteínas de reparo do DNA. A cinética de retenção e dissociação do XRCC1-GFP mostra uma dependência da dose (Figura 1), que não é inesperada dada a indução de misturas diferentes de dano por cada comprimento de onda. As maiores doses de irradiação (10 s e 0,5 fps) mostram um maior recrutamento de intensidade de XRCC1-GFP em relação as doses mais baixas e mais retenção do XRCC1-GFP no local do dano ao longo tempo de 20 min (Figura 1C). Isso indica que o dano de DNA criado em doses mais elevadas para 355 e 405 nm é provável não resolvido durante o curso da experiência, que é consistente com a aparência e a retenção de marcadores DSB, γH2AX e 53BP-1 (figuras 3 &#38; 4 ).
Curiosamente, as doses mais baixas de dano (2 s e fps 8) mostram rápido recrutamento de XRCC1-GFP para os sites de danos e dissociação de XRCC1-GFP ao longo do tempo experimental para níveis pré-irradiação (Figura 1C). Sem a caracterização completa da mistura de danos, isto pode levar à conclusão de que SSBs e lesões de base completamente são resolvidas usando estas condições prejudiciais. No entanto, a presença de γH2AX e 53BP-1 a 40 min para 355 nm e a 5 min para a 405 nm pode levar a diferentes interpretações. Para a dose de s 355 nm 2, a mistura de danos pode ser predominantemente SSBs, então a aparência dos marcadores de ORL em 40 min pode indicar que algumas lesões unrepaired podem estar levando a DSBs ou que DSBs geradas por essa energia são reparados em uma escala de tempo mais longa. Diferenças de escala de tempo entre SSBR e DSB reparação tem sido relatado anteriormente28,41,42. Da mesma forma, a dissociação de baixa dose (8 fps) 405 nm pode indicar um baixo nível de SSBs ou um cluster de SSBs que rapidamente são convertidos em DSBs, que tem sido notado por alta danificar DNA microirradiação e outro agentes nocivos anteriormente43, 44 , 45.
Juntos, estes resultados destacam a importância de caracterizar as misturas de danos induzidos e utilizando DNA de várias proteínas de reparação e marcadores para interpretar o recrutamento e a retenção de DNA reparar proteínas aos sítios de dano induzido.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
Figura 1 . Microirradiação do laser induz o recrutamento de XRCC1-GFP.  (A) CHO-K1 células expressando estàvel XRCC1-GFP foram irradiadas e fotografadas antes e imediatamente após a indução de danos. As setas indicam a localização da dose de irradiação de micro e barra de escala é 10 µm. (B) recrutamento é medido pela determinação da média intensidade fluorescente dentro os danos ROI e normalizando à média intensidade fluorescente do núcleo inteiro. (C) dinâmica de recrutamento podem ser medida para cada imagem de timelapse. Gráficos são representativas de dois experimentos independentes com barras de erro representando o SEM (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
Figura 2 . Microirradiação do laser induz dano de nucleotídeo.  Células CHO-K1 foram submetidas a microirradiação de laser e corrigidas imediatamente após a indução de danos. Realizou-se a imunofluorescência para detectar CPD e adutos de 8-oxodG. (A) top, gráfico de dispersão da fluorescência ROI média intensidades observadas em células danificadas depois da coloração da CPD. No fundo, imagens representativas de manchar o CPD. As setas indicam a localização de microirradiação e a barra de escala é de 10 µm (n = 12). (B) imagens representante para coloração de 8-oxodG. Setasindicar a localização de microirradiação e a barra de escala é 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
Figura 3 . Marcadores de DNA fita dupla ruptura respondem a 355 nm microirradiação de forma dose-dependente.  Células CHO-K1 foram submetidas a microirradiação e fixadas a tempo pontos indicado pós-estimulação. Realizou-se a imunofluorescência para o ORL marcadores γH2AX e 53BP-1. (A) dispersão de dano normalizado ROI dizer as intensidades de fluorescência medidas por células danificadas e sem danos. Barras de erro são representativos da SEM (n = 12). (B) representante imagens para γH2AX e 53BP-1 coloração. As setas indicam a localização de microirradiação e a barra de escala é 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
Figura 4. Marcadores de DNA fita dupla ruptura robustamente respondem a 405 nm microirradiação. Células CHO-K1 foram submetidas a irradiação de micro e fixadas para a estimulação de post indicado de pontos de tempo. Imunofluorescência para o ORL marcadores γH2AX e 53BP-1. (A) dispersão de dano normalizado ROI dizer as intensidades de fluorescência medidas por células danificadas e sem danos. Barras de erro são representativos da SEM (n = 12). (B) representante imagens para γH2AX e 53BP-1 coloração. As setas indicam a localização de microirradiação e a barra de escala é 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

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