Name: rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2017-10-30T14:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Garland initiativ for visjon, California Institutt for regenerativ medisin (CIRM, tilskudd DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 og TG2-01151), The Vermont samfunnet Foundation, The Breaux Foundation, og Foundation Fighting blindhet Wynn-Gund translasjonsforskning akselerasjon programmet.

1. forberedelse av reagenser dag 0 Day 14 av protokollen <ol><li>forberede følgende mellomstore komponenter: <ol><li>gjøre 100 mL av netthinnen differensiering medium (RDM) ved å legge til 1 mL av 100 x N2 supplement, 2 mL 50 x B27 supplement og 1 mL av 100 x ikke-essensielle aminosyren (NEAA) til 96 mL av Dulbecco &#39; s endret viktig middels/næringsstoff blanding F12 9 (DMEM/F12).</li>
		<li>Gjøre 10 mL 1 M nikotinamid (NIC) av oppløsning 1.221 g av NIC i 8 mL sterilt vann, vortexing og bringe volumet til 10 mL med sterilt vann. Sterile filtrere løsningen.</li>
	</ol></li> <li>Følgende vekstfaktorer og små molekyler: <ol><li>Rekonstituer rekombinant musen noggin, menneskelige dickkopf WNT signalnettverk veien hemmer 1 (DKK-1), og IGF-1 til 100 µg/mL hver i 0,1% bovin serum albumin (BSA) i fosfat-bufret løsning (PBS). Aliquot etter behov og butikk på 20 ° C for inntil 3 måneder.</li>
		<li>Rekonstituer FGF-grunnleggende 10 µg/mL og rekombinant humant/mus/rotte Activin A til 100 µg/mL hver i 0,1% BSA i PBS. Aliquot etter behov og butikk på-80 ° C i opptil 1 år.</li>
		<li>Rekonstituer SU 5402 (FGF reseptor-spesifikke tyrosin kinase inhibitor) og CHIR99021 (glykogen syntase kinase 3, GSK-3β, hemmer) 10 mm hver i dimethyl sulfoxide (DMSO). Aliquot og butikk på 20 ° C i opptil 1 år eller 6 måneder, henholdsvis.</li>
	</ol></li> <li>Få følgende for dag 0 og/eller dag 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning (0.2 g EDTA per 1 L PBS), 1 X PBS- / - (PBS uten kalsium eller magnesium, pH 7.4), 1 x trypsin som dissosiasjon enzym (TDE), DPBS (Dulbecco &#39; s PBS), RPE støtter medium (RSM) og Y-27632 dihydrochloride (bruk på 10 µM).</li>
</ol> 2. : 0 dag av Pluripotent stamceller passasje for differensiering <ol><li>voksen stilk cellen kolonier i mater-fri, serum-free forhold til ca 80% samløpet før passaging. 
	Merk: Se diskusjon for detaljer om optimalisering dette trinnet.</li>
	<li>Coat en 12-vel plate med ekstracellulær matrix-baserte hydrogel (ECMH) ifølge produsenten anbefalinger. Lar angi 1t ved romtemperatur eller over natten på 4 ° C.</li>
	<li>Aliquot volumet av RDM og PBS- / - behov for dag 0 og varme i et vannbad 37 ° c før du legger til vekstfaktorer. Få EDTA til romtemperatur.</li>
	<li>Legge vekstfaktorer nødvendig for dag 0 til varmet RDM med 10 mM NIC, 50 ng/mL noggin, 10 ng/mL DKK-1 og 10 ng/mL IGF-1. Fra aksjene som beskrevet i trinn 1.2, legge 100 µL av NIC, 5 µl av noggin, 1 µL av DKK-1 og 1 µL av IGF-1 til 10 mL av RDM.</li>
	<li>Velge for å fjerne alle differensiert kolonier basert på morfologi stammen celler som vil bli passaged for differensiering. Bruk en P10 Pipetter tips å manuelt fjerne differensierte celler. 
	Merk: Fibroblastic celler mellom kolonier samt ugjennomsiktig cellene i koloniene indikerer differensierte celler fjernes. Se diskusjon for detaljer om differensierte celler.</li>
	<li>Passasje en enkelt brønn av en 6-vel plate i 4 brønner av en 12-vel plate (1:4). 
	Merk: Se diskusjon for detaljer på passaging stamceller på dette stadiet.
	<ol><li>Sug opp stamcelleforskningen mediet stamceller og vaske brønnene gang med 2 mL forvarmes PBS- / -.</li>
		<li>Sug opp PBS- /- og skyll godt tre ganger med 1 mL av EDTA per brønn av en 6-vel plate.</li>
		<li>Forsiktig tilt platen og Sug opp EDTA. Ikke rist platen i noen måte å unngå for tidlig løfte cellene.</li>
		<li>Etter tredje vask, Legg 1 mL av EDTA og ruge ved romtemperatur i panseret for 3-5 minutter. Ikke forstyrr platen under denne inkubasjonen.</li>
		<li>Sug opp EDTA og tilsett 1 mL av RDM per brønn som vil bli sådd med 0,5 mL av ekstra medium. For eksempel vaske 1 godt av en 6-vel plate med 4,5 mL RDM platen på 4 brønner av en 12-vel plate.</li>
		<li>Bruk cellen skraper å forsiktig koble cellene. Samle alle celler i en konisk rør og triturate cellene i RDM av pipettering opp og ned 5 ganger. Distansere store klumper av celler, men ikke triturate til enkelt celle suspensjon. Distribuere cellene i pipetter. Fullfører dette trinnet raskt for å hindre reattachment av platen.</li>
		<li>Frø celler på ECM-belagt 12-vel plater (1 mL av cellen suspensjon per brønn).</li>
		<li>Tilt platen og tilbake for å distribuere cellene hele brønnene. Forsiktig plassere i en celle kultur inkubator på 37 ° C og 5% CO 2 til neste medium endring.</li>
		<li>Oppmerksom på nøyaktig tid. Endre medium på samme tid hver dag.</li>
	</ol></li></ol> 3. Dag 1 til 14: tillegg av vekstfaktorer <ol><li>dag 1: endre mediet på alle brønner (1 mL per brønn) med RDM vekstfaktor sammensetningen dag 0 (se trinn 2.4).</li>
	<li>Dag 2: endre mediet bruker RDM (1 mL per brønn) med 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-grunnleggende, 10 ng/mL noggin, 10 ng/mL DKK-1 og 10 ng/mL IGF-1. Fra aksjene som beskrevet i trinn 1.2, legge 100 µL av NIC, 5 µL av FGF-basic, 1 µL av noggin, 1 µL av DKK1 og 1 µL av IGF1 til 10 mL av RDM.</li>
	<li>Dag 4: endre mediet bruker RDM (1 mL per brønn) med 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1 og 10 ng/mL IGF-1. Fra aksjene som beskrevet i trinn 1.2, legge 10 µL av activin A, 1 µL av DKK1 og 1 µL av IGF-1 til 10 mL av RDM. 
	Merk: Observere at cellene er confluent på dette stadiet.</li>
	<li>Dag 6: endre mediet bruker RDM (1 mL per brønn) med 100 ng/mL activin A og 10 µM SU 5402. Fra aksjene som beskrevet i trinn 1.2, legge 10 µL av activin og 10 µL av SU 5402 10 mL RDM.</li>
	<li>Dager 8, 10 og 12: endre mediet bruker RDM (1 mL per brønn) med 100 ng/mL activin A, 10 µM SU 5402 og 3 µM CHIR99021. Fra aksjene som beskrevet i trinn 1.2, legge 10 µL av activin A, 10 µL av SU 5402 og 3 µL av CHIR99021 til 10 mL av RDM.</li>
</ol> 4. Dag av berikelse å 0 tidens RPE <ol><li>Coat en 6-vel plate med vekstfaktor redusert ECMH ifølge produsenten anbefalinger. Lar angi 1t ved romtemperatur eller over natten på 4 ° C.</li>
	<li>Aliquot volumet av DPBS behov og 1 mL av RDM per brønn av berikelse og varm i et vannbad til 37 ° C. Bring TDE til romtemperatur og varm nødvendig volum RSM, antimikrobielle reagens og Y-27632 til 37 ° C.</li>
	<li>Legg til antimikrobielle reagens og Y-27632 0.5 x og 10 µM komposisjoner henholdsvis til RSM. Bruke dette mediet for det første 4-7 dager å forbedre vedlegget.</li>
	<li>Leveringstanken brukte medium fra alle brønnene og legge 1 mL per brønn av forvarmes RDM (ingen vekstfaktorer kreves).</li>
	<li>Bruker dissecting mikroskop, analysere og skrape bort alle ikke-RPE-celler med en P10 Pipetter tips manuelt. 
	Merk: Se representant resultatinndelingen eksempler.</li>
	<li>Etter disseksjon, Sug opp RDM og alle celle rusk. Vask to ganger med 1 mL av forvarmes DPBS per brønn.</li>
	<li>Legg til 0,5 mL TDE per brønn av en 12-vel plate og ruge ved 37 ° C i 5 min. Bruk cellen skraper å forsiktig fjerne celler fra platen. Bruke en P1000 Pipetter til forsiktig triturate celle/TDE suspensjon av pipettering opp og ned 3 - 4 ganger å opprette en ensartet suspensjon.</li>
	<li>Fortynne cellen/TDE suspensjon 1:10 i forvarmes RSM, uten Y-27632. Sentrifuge celle suspensjon 173 x g i 5 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Sug opp mediet celle pellets og resuspend cellene i RSM med 10 µM Y-27632 (1 mL per beriket vel).</li>
	<li>Belastning cellene med en nylon maske celle sil med 40 µm porene. Teller antall celler i et bestemt volum ved hjelp av en hemocytometer og Beregn konsentrasjonen celler i anstrengt løsningen.</li>
	<li>Frø celler i vekstfaktor redusert ECM-belagte plater på 1 x 10 5 celler/cm 2 i 4 mL RSM med 10 µM Y-27632.</li>
	<li>Erstatte RSM med 10 µM Y-27632 48 timer etter celle såing og fortsette å erstatte media hver 3-4 dager (f.eks på mandager og torsdager). Erstatter ikke den 10 µM Y-27632 etter 4-7 dager.</li>
	<li>At cellene å modne for 28 til 35 dager på 37 ° C og 5% CO 2. Fortsette å erstatte RSM hver 3-4 dager (f.eks på mandager og torsdager).</li>
</ol> 5. Modning: Passasje 1 og 2 av RPE Merk: volumer er angitt for 1 godt av en 6-vel-plate eller en MT75 kolbe som indikert av parenteser.
<ol><li>Mellom dager 28 til 35 passasje 0, pels en 6-vel-plate (MT75 kolbe) med ECMH som produsenten anbefalinger.</li>
	<li>Aliquot volumet av DPBS og RSM nødvendig og varme i et vannbad til 37 ° C. bringe TDE til romtemperatur.</li>
	<li>Leveringstanken brukte medium fra brønner og vaske godt to ganger med 2 mL (10 mL) forvarmes DPBS. 
	Merk: Ikke bruk 10 µM Y-27632.</li>
	<li>Sug opp DPBS og legge 1 mL (5 mL) TDE. Sett i inkubator på 37 ° C og 5% CO 2 i 5 min. Etter inkubasjon Vis celler i en invertert mikroskop for å bekrefte cellene er kontraktørselskaper og detaching.</li>
	<li>Bruker en passende stor celle skraper, forsiktig fjerne celler fra bunnen av brønnen eller kolbe.</li>
	<li>Bruker et P1000 tips (10 mL serologisk Pipetter) til forsiktig triturate celle/TDE suspensjon opp og ned 3 - 4 ganger å opprette en ensartet suspensjon.</li>
	<li>Fortynne celle suspensjon 1:10 i RSM. Reservere 2 mL (5 mL) av RSM Skyll godt/kolbe og legge til utvannet celle suspensjon. 
	Merk: Ikke Tillat enzym eksponeringstid å overskride 25 min.</li>
	<li>Sentrifuge celle suspensjon 173 x g i 5 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Sug opp mediet celle pellets og resuspend cellene i 1 mL (5 mL) av RSM</li>
	<li>Belastning cellene med en nylon maske celle sil med 40 µm porene. Teller antall celler i et bestemt volum ved hjelp av en hemocytometer og Beregn konsentrasjonen celler i anstrengt løsningen.</li>
	<li>Frø celler på ECMH-belagt plater på 1 x 10 5 celler/cm 2 i 4 mL (15 mL) RSM.</li>
	<li>At cellene å modne i 30 dager. Fortsette å endre RSM hver 3-4 dager.</li>
	<li>Gjenta den ovenstående prosedyren (trinn 5.2-5.11) på dag 30 til passasje cellene fra passering 1 til 2.</li>
</ol> 6. Opprette en mellomliggende cellen Bank: kryonisk bevaring av passasje 2 dag 3-5 RPE Merk: Cryopreserve celler mens de er subconfluent (~ 50%) og har ikke fått tilbake pigment.
<ol><li>Basert på antall celler, beregne volumet av kryonisk bevaring medium med 10% DMSO måtte resuspend cellene i en konsentrasjon av 3 x 10 6 celler/mL.</li>
	<li>Følge trinnene 5.2 til 5,8. Resuspend celle pellet i kryonisk bevaring medium med 10% DMSO til 3 x 10 6 celler/mL og overføre 1 mL av cellen suspensjon til 1,2 mL kryogene hetteglass.</li>
	<li>Plasseres kryogene ampuller i frysing beholder avkjøle for-1 ° C/min og sted på-80 ° C over natten. Overføre til flytende nitrogen for langtidslagring. 
	Merk: Disse cellene blir passering 3 ved tining. Kultur cellene for 30 dager før karakterisering. Frø passasje 3 RPE på 1,5 x 10 5 per cm 2 ved tining. 2 , 4 , 6 , 7</li></ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Making+Stem+Cells+Retinal:+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+With+Ocular+Disease.">Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Based+Therapies+in+Combination+with+Substrate+for+the+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration.">Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).</li><li>Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium.">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li><li>Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Pigment+Epithelial+Cells:+Development+In+Vivo+and+Derivation+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+In+Vitro+for+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration.">Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).</li><li>Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical/&#946;-catenin+Wnt+pathway+activation+improves+retinal+pigmented+epithelium+derivation+from+human+embryonic+stem+cells.">Canonical/&#946;-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+xeno-free+derivation+of+retinal+pigmented+epithelial+cells+on+a+novel,+synthetic+substrate.">Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate.</a> Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).</li><li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium:+A+Comparative+Study+Between+Cell+Lines+and+Differentiation+Methods.">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li><li>Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Choudhary, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+Toward+Retinal+Pigment+Epithelium+Lineage.">Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage.</a> Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).</li><li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-directed,+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li><li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+efficient+retinal+pigment+epithelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+spontaneous+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).</li><li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li><li>Croze, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibition+Extends+Passage+of+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium.">ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).</li></ol>

Dr. Clegg er medgrunnlegger av regenererende Patch Technologies LLC.

Denne protokollen beskriver hvordan produsere netthinnens pigment epitelceller fra pluripotent stamceller. Metoden ble optimalisert ved hjelp av både menneskelige embryonale og indusert pluripotent stamceller fra en mater-fri, serum-fri kultur-metode. Siden første isolering av menneskelige embryonale stamceller i 1998 og avledning av indusert pluripotent stamceller (iPSC) i 2007, en rekke stamcelleforskningen kultur metoder har blitt utviklet14,15,16, 17. Disse metodene bør være tilstrekkelig for å produsere stamcelleforskningen koloniene som er utsatt for denne differensiering. Det er ingen kjente begrensninger til anvendelsen av denne metoden å riktig avledet og vedlikeholdt pluripotent stamceller.
De viktigste trinnene er passaging av stamceller dag 0 av differensiering (trinn 2.5) og behovet for manuell disseksjon på dag 14 av prosessen (trinn 4.5). Når plukke fjerne differensierte celler fra stamcelleforskningen koloniene, se bildene i Kent18. Som indikert, angi fibroblastic cellene mellom kolonier og ugjennomsiktig cellene i koloniene differensierte celler som må fjernes før du begynner denne protokollen18. Bare udifferensierte, tett pakket kolonier med definerte kanter bør være passaged for differensiering.
Antall stamceller seeded per brønn (trinn 2.6.7) er komplisert ved det faktum at stamceller kan ikke være triturated i en enkelt celle suspensjon på passasje og kan ikke telles nøyaktig ved hjelp av en hemocytometer. Tilnærming av 80% confluent stamceller er angitt for passaging 1 godt av en 6-vel plate i 4 brønner av en 12-vel plate. Forskjeller mellom stamcelleforskningen linjer, for eksempel vekst, kan påvirke hvor raskt den umodne RPE nå samløpet mellom dager 0 til 4. Stamceller vil produsere RPE uansett nøyaktig samløpet, men cellen avkastningen vil påvirkes negativt hvis cellene er for sparsom på dette stadiet. Umoden RPE cellene bør være ca 40-50% confluent på dag 1 og nesten 100% confluent dag 4. Hvis cellene ikke produserer en confluent monolayer dag 4 eller 6, skal protokollen gjentas på en høyere seeding tetthet på dag 0. For eksempel hvis 1 godt av en 6-vel plate var passaged 4 brønner av en 12-vel plate på dag 0 og den umodne RPE er ikke 100% confluent på dag 4, redusere frø til en 1:3 eller 1:2 passasje på dag 0 eller tillate stamceller blir mer confluent før passaging. Det er viktig å etablere en konsekvent seeding tetthet når du sammenligner flere linjer.
Manuell disseksjon trinnet på dag 14 er bare nødvendig når ikke-RPE celler finnes i kultur (figur 2C). Siden tillegg av CHIR99021 i protokollen krever mange pluripotent stilk cellen lite eller ingen manuell disseksjon. Noen forberedelser har en høyere forekomst av nevrale oppdateringer og det er viktig å fjerne disse cellene. Hvis RPE ikke levedyktig på passage 0 gjennom passering 3, er det mulig å gjenta differensiering protokollen tar nok tid til å fjerne alle ikke-RPE celler. Dette skjer ikke ofte, men det er nevnt her for å merke seg at disseksjon trinnet på dag 14 kan optimaliseres ved behov.
Det finnes en rekke RPE differensiering protokoller som varierer i pris samt kultur metoder, effektivitet, kvantifisering og funksjonell vurdering, som har vært vurdert grundig2. Vi foretrekker metoden 14 dagers detaljert her på grunn av sin effekt, tilpasningsevne og anvendelighet til et bredt spekter av cellen linjer4,7,8. Kryonisk bevaring trinnet i denne protokollen gir også en stor fordel i å skape en mellomliggende cellen bank for fremtidig bruk, unngå parti til parti variasjon i eksperimenter. Starter med bare 4 brønner av en 12-vel plate, er det mulig å utvide til 6-vel plater på passage 0 og MT75 flasker på passering 1 og 2. På passage 2 dag 3-5, når cellene er fortsatt subconfluent og har ikke fått tilbake pigment, er det mulig å cryopreserve millioner av celler og deretter tine den eldre RPE, utpekt passering 3 dagers 30, for å sjekke RNA uttrykk, protein uttrykk, vekstfaktor sekresjon, fagocytose, etc. Vi har også etablert for å utvide RPE for opp til 13 passasjer 19.
Gleder oss, vil denne metoden være nyttig for iPSC modellering av okulær sykdom og generasjon RPE for mobilnettet terapi. Med hensyn til iPSC sykdom modellering brukes denne protokollen for øyeblikket i laboratoriet til å produsere RPE fra CRISPR-korrigert linjene med ikke-korrigert kontroller fra samme pasient. Videre er denne protokollen tilpasningsdyktig syntetiske underlag og xeno uten betingelser som er nyttige for å overholde de anbefalte fremgangsmåtene kreves for mobilnettet terapi.

Netthinnens pigment epitel er en monolayer av pigmentert celler som støtter avgjørende fotoreseptorer. Netthinnens pigment epitelceller (RPE) har mange funksjoner i visjon, inkludert lys absorpsjon, Nærings-og ion, retinoid sykling, photoreceptor ytre segmentet fagocytose, og vekst faktor sekresjon1. Det finnes en rekke retinal dystrophies som påvirker funksjon RPE og resulterer i tap av syn, inkludert alder makuladegenerasjon og retinitis pigmentosa. Generasjon av RPE fra pluripotent stamceller kan lette undersøkelser for å forstå disse øyesykdommer og kan gi en ubegrenset kilde av RPE for cellen terapi2. Faktisk, bruker flere kliniske studier i gang RPE avledet fra pluripotent stamceller3.
Denne differensieringen protokollen ble opprinnelig beskrevet av Buchholz4 og var basert på tidligere publiserte metoden Clegg5. Prosedyren etterligner normal i vivo utviklingsprosessen for direkte udifferensierte pluripotent stamceller mot en RPE skjebne via manipulering av insulin vekstfaktor (IGF), grunnleggende fibroblast vekst faktor (FGF-2; FGF-basic), transformasjon av vekstfaktor beta (TGF-β) og WNT trasé4,5. Protokollen ble forbedret med tillegg av en WNT veien Agonistiske sent i protokollen, som ga 97.77% ± 0,1% pre-melanosome protein (PMEL) positive celler, og har blitt tilpasset xeno uten betingelser6,7. Den resulterende RPE har vist å uttrykke RPE markører på transkripsjon og protein, skiller kjent RPE vekstfaktorer med riktig polaritet og utføre fagocytose photoreceptor ytre segmenter8. Denne protokollen er raskere og pålitelig enn "spontan" protokoller av differensiering som involverer enkel fjerning av grunnleggende fibroblast vekstfaktor8. Videre RNA sekvensering data viser at RPE fikk bruker denne protokollen er svært like de oppnådd ved hjelp av de vanligste spontane tilnærming8. 14-dag-metoden genererer RPE som passer "5 P's" nevnt av Mazzoni9 (pigmentert, polarisert, phagocytic, etter mitotisk, mangekantet)9. Mens denne prosedyren har vist seg for å være reproduserbar i flere labs, ønsker vi å erkjenne flere ekstra rettet differensiering metoder som er publisert i siste årene10,11,12 , 13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>model: SG603A-HE, type: A2, class: 2</td>
			<td>6&#39; Baker laminar flow biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Model 3970405</td>
			<td>laminar flow bench top</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1500</td>
			<td>heated stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-17AIC</td>
			<td>37 oC and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse noggin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1967-NG-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human DKK-1</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>5439-DK-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant IGF-1</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human/mouse/rat Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402 FGF inhibitor</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-204308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>growth factor reduced ECMH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Versene (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 10 (RPE supporting medium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BW04-743Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>12-541-0 (1254)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>210102</td>
			<td>cryopreservation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 mL Cryogenic Vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty (freezing container)</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td>antimicrobial reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3516</td>
			<td>Used during differentiation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td>Used during RPE maturation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3513</td>
			<td>Used during RPE maturation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-1A</td>
			<td>Used during passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Used during passages before cell count.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells

Vi beskriver en robust metode for direkte differensiering av pluripotent stamceller i retinal pigment epitelceller (RPE). Formålet å gi en detaljert og grundig protokoll er tydelig vise hvert trinn og gjøre dette lett tilgjengelig for forskere innen. Denne protokollen gir et homogent lag av RPE med minimal eller ingen manuelle disseksjon nødvendig. Metoden som presenteres her har vist seg å være effektive for indusert pluripotent stamceller (iPSC) og menneskelige embryonale stamceller. I tillegg beskriver vi metoder for kryonisk bevaring av mellomliggende cellen banker at langvarig lagring. RPE genereres ved hjelp av denne protokollen kan være nyttig for iPSC sykdom-i-en-fat modellering eller klinisk anvendelse.

Denne metoden resulterer i produksjon av en homogen, pigmentert og kubisk monolayer av RPE. Tidslinjen i figur 1 tilsvarer bildene avbildet i figur 2. Som vist i figur 2A, er Stamcelle koloniene tett pakket med definerte kanter og ingen fibroblastic celler mellom kolonier eller ugjennomsiktig celler i koloniene. Figur 2B gir en representasjon av umodne RPE som er subconfluent. Hvis cellene er allerede confluent på dette stadiet, kan ikke de utvide anslag som er kritiske til differensiering prosessen. Celler som er alvorlig subconfluent vil ikke kunne etablere en monolayer og danne tett veikryss, karakteristisk for epitel. Informasjon om hvordan du optimaliserer samløpet er beskrevet under diskusjon. Figur 2C viser morfologi av de to vanligste typene ikke-RPE som kan oppstå underveis differensiering: nevrale eller fibroblastic patcher. Det er viktig å merke seg at disse nevrale oppdateringene vises spesielt ugjennomsiktig på dissecting mikroskop, mens definerte, fibroblastic-lignende patcher er nesten gjennomsiktig på dissecting mikroskop. Det kan være nyttig å merke disse områdene på en vev kultur plate med en etanol-bevis lab penn lettere identifisere dem både en sammensatt lys mikroskop og dissecting mikroskop. Tallene 2D-F viser karakteristiske lyse grenser, brosteinsbelagte morfologi og pigment som angir en sunn, modning kultur for RPE. Figur 3 er en høyere forstørrelse image å vise forskjellige utseendet på fullt moden RPE avbildet av kontrast og lys feltet mikroskopi. På passering er 3 dagers 30, cellene klar for karakteristikken at har blitt beskrevet i tidligere publikasjoner, inkludert RNA uttrykk, protein uttrykk, vekstfaktor sekresjon og fagocytose2,4,6 ,7. Disse karakteristikkene viser at cellene representert i disse bildene er ikke bare pigmentert og kubisk, men også phagocytic etter mitotisk og polarisert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
Figur 1:. Tidslinje for tillegg av vekstfaktorer og modning av RPE. Vekstfaktorer legges til 12-vel plater fra dag 0-14. Modning RPE er kultivert i 6-vel plater eller MT75 flasker fra dag berikelse å 30 dager etter Tin (passering 3 dagers 30). Pilene angir enzymatisk celle passaging. (AE) under tidslinjene samsvarer med bildene i figur 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
Figur 2: representant morfologi og samløpet modning RPE. Indusert pluripotent stamceller umiddelbart før passaging for differensiering (A). Umoden RPE celler subconfluent på dag 2 (B) og før plukke å fjerne berikelse på dag 14; ikke-RPE oppdateringer (angitt med hvite piler) vises som flekker eller ugjennomsiktig "bånd" (C). RPE på passage 0, 1 og 3 på dag 30 (D, E og F). Skala bar = 200 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
Figur 3: eldre RPE på passering 3: dag 30 Kubisk morfologi avbildet i kontrast (A) og pigmentering i lyse-feltet (B). Skala bar = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Denne protokollen beskriver hvordan produsere netthinnens pigment epitelceller (RPE) fra pluripotent stamceller. Metoden bruker en kombinasjon av vekstfaktorer og små molekyler til direkte differensiering av stamceller i umodne RPE i fjorten dager og modne, funksjonelle RPE etter tre måneder.

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effektiv Utledning av retinal pigment epitelet Celler fra stamceller

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Stammer Netthinne Pigment Epitel (RPE) fra Induced pluripotent Stem (IPS) Cells av forskjellige størrelser av embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Dyrke Primær Nasal Epitelceller fra Barne- og omprogrammere inn Utførte Pluripotent stamceller

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rapid neuronal Differensiering av Induced Pluripotent stamceller for måling Network Aktivitet på Micro-elektrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av Primitive og Definitive blodkreft Progenitors fra menneskelige Pluripotent stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differensiering av menneskelige pluripotent stamceller til trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differensiering av kondrocytter fra perifert blod-avledede humane inducerte pluripotente stamceller

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Engineering transplantasjon-passer netthinnens Pigment epitel vev avledet fra menneskelige embryonale stamceller

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv og skalerbar rettet differensiering av klinisk kompatibel hornhinnen Limbal epitel stamceller fra menneskelige Pluripotent stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...