Name: rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2017-10-30T14:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av initiativet Garland för syn, California Institute för regenerativ medicin (CIRM; bidrag DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 och TG2-01151), The Vermont gemenskapen Foundation, The Breaux Foundation, och den Stiftelsen kämpar blindhet Wynn-Gund translationell forskning Acceleration Program.

1. beredning av reagens för dag 0 till dag 14 i protokollet <ol><li>förbereda följande medelstora komponenter: <ol><li>göra 100 mL av retinal differentiering medium (RDM) genom att tillsätta 1 mL 100 x N2 tillägg, 2 mL 50 x B27 tillägg och 1 mL 100 x icke-essentiell aminosyra (NEAA) till 96 mL Dulbecco &#39; s modified viktigt medium/näringsämne blandning F12 9 (DMEM/F12).</li>
		<li>Göra 10 mL 1 M nikotinamid (NIC) av Proteinupplösande 1.221 g av NIC 8 mL sterilt vatten, vortexa och föra volymen med 10 mL sterilt vatten. Steril filtrera lösningen.</li>
	</ol></li> <li>Förbereda följande tillväxtfaktorer och små molekyler: <ol><li>Rekonstituera rekombinant mus skalle, mänskliga dickkopf WNT signalering utbildningsavsnitt hämmare 1 (DKK-1), och IGF-1 till 100 µg/mL varje i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbuffrad lösning (PBS). Alikvot som behövs och förvaras vid-20 ° C i upp till 3 månader.</li>
		<li>Beredes FGF-basic till 10 µg/mL och rekombinant mänskliga/mus/råtta Activin A till 100 µg/mL varje i 0,1% BSA i PBS. Alikvot som behövs och förvaras vid-80 ° C upp till 1 år.</li>
		<li>Beredes SU 5402 (FGF receptor-specifika tyrosinkinashämmare) och CHIR99021 (glykogen syntetas kinase 3, GSK-3β, hämmare) 10 mm och varje dimetyl sulfoxid (DMSO). Delprov och förvaras vid-20 ° C i upp till 1 år eller 6 månader, respektive.</li>
	</ol></li> <li>Erhålla följande för dag 0 och dag 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic syra (EDTA) lösning (0.2 g EDTA per 1 L PBS), 1 X PBS- / - (PBS utan kalcium eller magnesium, pH 7,4), 1 x trypsin-liknande dissociation enzym (TDE), DPBS (Dulbecco &#39; s PBS), RPE stödja medium (RSM) och Y-27632 dihydroklorid (Använd vid 10 µM).</li>
</ol> 2. Dag 0: Dag av pluripotenta stamceller Passage för differentiering <ol><li>odla stamceller kolonier i feeder-fri, serumfritt villkor till ungefärligt 80% sammanflödet innan passaging. 
	Obs: Se diskussion för detaljer om hur du optimerar detta steg.</li>
	<li>Coat en 12-well platta med extracellulära matrix-baserade hydrogel (ECMH) enligt tillverkarens rekommendationer. Tillåta för att ställa för 1 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.</li>
	<li>Alikvot volymen av RDM och PBS- / - behövs för dag 0 och varm i vattenbad till 37 ° C innan du lägger till tillväxtfaktorer. Ta EDTA rumstemperatur.</li>
	<li>Lägga till tillväxtfaktorerna som behövs för dag 0 att den värmde RDM med 10 mM NIC, 50 ng/mL skalle, 10 ng/mL DKK-1 och 10 ng/mL IGF-1. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, tillsätt 100 µL av NIC, 5 µl skalle, 1 µL DKK-1 och 1 µL av IGF-1 till 10 mL RDM.</li>
	<li>Plocka bort alla differentierade kolonier baserat på Morfologi från stamceller som kommer att vara passaged för differentiering. Använda en P10 Pipettera spets att manuellt ta bort de differentierade cellerna. 
	Obs: Fibroblastic celler mellan kolonier, liksom ogenomskinlig cellerna inom kolonier tyder differentierade celler tas bort. Se diskussion för mer information om differentierade celler.</li>
	<li>Passage en enda väl 6-well platta i 4 brunnar 12-well platta (1:4). 
	Obs: Se diskussion för detaljer om passaging stamceller i detta skede.
	<ol><li>Aspirera stamceller mediet från stamceller och Tvätta brunnarna en gång med 2 mL före värmde PBS- / -.</li>
		<li>Aspirera PBS- /- och skölj varje väl tre gånger med 1 mL av EDTA per brunn 6-well platta.</li>
		<li>Försiktigt luta plattan och aspirera på EDTA. Inte agitera plattan på något sätt att undvika att tidigt lyfta cellerna.</li>
		<li>Efter den tredje tvätten, tillsätt 1 mL av EDTA och odla i rumstemperatur i huven för 3-5 min. Stör inte plattan under denna inkubation.</li>
		<li>Sug ut EDTA och tillsätt 1 mL RDM per brunn som att dirigeras med 0,5 mL extra medium. Till exempel tvätta 1 väl av en 6-well platta med 4,5 mL av RDM plattan på 4 brunnar 12-well platta.</li>
		<li>Använda en cell-skrapa försiktigt bort cellerna. Samla alla celler i ett koniskt rör och pulverisera cellerna i RDM genom pipettering upp och ner 5 gånger. Separera stora klumpar av celler, men inte pulverisera till enda cellsuspension. Distribuera cellerna jämnt i Pipettera. Slutföra detta steg snabbt för att förhindra återfastsättning av till plattan.</li>
		<li>Utsäde cellerna på ECM-belagd 12-väl plattor (1 mL cellsuspension per brunn).</li>
		<li>Luta plattan och tillbaka för att distribuera cellerna jämnt i brunnarna. Placera försiktigt i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 tills nästa medium förändring.</li>
		<li>Observera den exakta tiden. Förändring mediet vid samma tid varje dag.</li>
	</ol></li></ol> 3. Dag 1 till 14: tillägg av tillväxtfaktorer <ol><li>dag 1: ändra mediet på alla brunnar (1 mL per brunn) med hjälp av RDM med tillväxtfaktor sammansättning för dag 0 (se steg 2,4).</li>
	<li>Dag 2: ändra mediet använder RDM (1 mL per brunn) med 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-basic, 10 ng/mL skalle, 10 ng/mL DKK-1 och 10 ng/mL IGF-1. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, tillsätt 100 µL av NIC, 5 µL av FGF-basic, 1 µL skalle, 1 µL av DKK1 och 1 µL IGF1 10 ml av RDM.</li>
	<li>Dag 4: ändra mediet använder RDM (1 mL per brunn) med 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1 och 10 ng/mL IGF-1. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, tillsätt 10 µL av activin A, 1 µL av DKK1 och 1 µL av IGF-1 till 10 mL RDM. 
	Obs: Observera att cellerna är konfluenta i detta skede.</li>
	<li>Dag 6: ändra mediet använder RDM (1 mL per brunn) med 100 ng/mL activin A och 10 µM SU 5402. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, Lägg till 10 µL av activin A och 10 µL av SU 5402 till 10 mL RDM.</li>
	<li>Dagar 8, 10 och 12: ändra mediet använder RDM (1 mL per brunn) med 100 ng/mL activin A, 10 µM SU 5402 och 3 µM CHIR99021. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, tillsätt 10 µL av activin A, 10 µL SU 5402 och 3 µL av CHIR99021 10 ml av RDM.</li>
</ol> 4. Dag av berikning till passagen 0 av RPE <ol><li>Coat en 6-well platta med tillväxtfaktor minskas ECMH enligt tillverkarens rekommendationer. Tillåta för att ställa för 1 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.</li>
	<li>Alikvot volymen av DPBS behövs och 1 mL RDM per brunn av anrikning och varm i vattenbad till 37 ° C. Bring TDE till rumstemperatur och varma nödvändig volym av RSM, antimikrobiell reagens och Y-27632 till 37 ° C.</li>
	<li>Lägg till antimikrobiell reagens och Y-27632 att få 0,5 x och 10 µM kompositioner respektive till RSM. Använda detta medium för de första 4-7 dagarna att förbättra fastsättning.</li>
	<li>Aspirera förbrukade medel från alla borrningar och tillsätt 1 mL per brunn av pre värmde RDM (ingen tillväxt faktorer krävs).</li>
	<li>Manuellt med dissekera Mikroskop dissekera och skrapa bort alla icke-RPE-celler som använder en P10 Pipettera spets. 
	Obs: Se avsnittet representativa resultat för exempel.</li>
	<li>Efter dissektion, aspirera RDM och alla cell skräp. Tvätta två gånger med 1 mL före värmde DPBS per brunn.</li>
	<li>Tillsätt 0,5 mL TDE per brunn 12-well platta och inkubera vid 37 ° C i 5 min. Använd en cell skrapa försiktigt bort cellerna från plattan. Använda en P1000 Pipettera till försiktigt pulverisera cell/TDE suspensionen genom pipettering upp och ner 3 - 4 gånger till skapa en homogen suspension.</li>
	<li>Späd cell/TDE suspensionen 1:10 i förväg värmde RSM, utan Y-27632. Centrifugera cellsuspension på 173 x g under 5 minuter i rumstemperatur.</li>
	<li>Aspirera på medellång från cellpelleten och resuspendera cellerna i RSM med 10 µM Y-27632 (1 mL per berikad brunn).</li>
	<li>Stam celler med en nylon mesh cell SIL med 40 µm porer. Räkna antalet celler i en angiven volym med hjälp av en hemocytometer och beräkna koncentrationen av celler i den ansträngda lösningen.</li>
	<li>Utsäde celler på tillväxtfaktorn minskas ECM-belagda plattor på 1 x 10 5 celler/cm 2 i 4 mL RSM med 10 µM Y-27632.</li>
	<li>Ersätta RSM med 10 µM Y-27632 48 h efter cell sådd och fortsätta att ersätta media var 3-4-dagar (t.ex. på måndagar och torsdagar). Ersätter inte de 10 µM Y-27632 efter 4-7 dagar.</li>
	<li>Låta cellerna att mogna i 28-35 dagar vid 37 ° C och 5% CO 2. Fortsätta att ersätta RSM var 3-4-dagar (t.ex. på måndagar och torsdagar).</li>
</ol> 5. Mognad: Passage 1 och 2 av RPE Obs: volymer är indicerat för 1 väl av en 6-well platta eller en T75 kolv som indikeras av parenteser.
<ol><li>Mellan 28-35 dagar efter passage 0, coat en 6-well platta (T75 kolv) med ECMH enligt tillverkarens rekommendationer.</li>
	<li>Alikvot volymen av DPBS och RSM behövs och varm i vattenbad till 37 ° C. ta TDE rumstemperatur.</li>
	<li>Aspirera tillbringade varje medium från brunnarna och tvätta väl två gånger med 2 mL (10 mL) före värmde DPBS. 
	Obs: Använd inte 10 µM Y-27632.</li>
	<li>Aspirera DPBS och tillsätt 1 mL (5 mL) TDE. Placera i inkubatorn på 37 ° C och 5% CO 2 för 5 min. Efter inkubation, Visa celler på en inverterade Mikroskop till bekräfta cellerna avtalsslutande och frikoppla.</li>
	<li>Med hjälp av en lämplig storlek cell skrapan, ta försiktigt bort cellerna från botten av brunnen eller kolv.</li>
	<li>Använda ett P1000 tips (10 mL serologiska Pipettera) att försiktigt pulverisera cell/TDE suspensionen upp och ner 3 - 4 gånger till skapa en homogen suspension.</li>
	<li>Späd cell suspension 1:10 i RSM. Reservera 2 mL (5 mL) av RSM skölj väl/kolven och Lägg till den utspädda cellsuspensionen. 
	Obs: Låt inte enzymet exponeringstiden överstiger 25 min.</li>
	<li>Centrifugera cellsuspension på 173 x g under 5 minuter i rumstemperatur.</li>
	<li>Aspirera på medellång från cellpelleten och resuspendera cellerna i 1 mL (5 mL) av RSM</li>
	<li>Stam celler med en nylon mesh cell SIL med 40 µm porer. Räkna antalet celler i en angiven volym med hjälp av en hemocytometer och beräkna koncentrationen av celler i den ansträngda lösningen.</li>
	<li>Utsäde celler på ECMH-belagda plattor på 1 x 10 5 celler/cm 2 4 ml (15 mL) av RSM.</li>
	<li>Låta cellerna att mogna i 30 dagar. Fortsätta att ändra RSM varje 3-4 dagar.</li>
	<li>Upprepa ovanstående procedur (steg 5.2-5.11) vid dag 30 till passage cellerna från passage 1 till 2.</li>
</ol> 6. Skapa en mellanliggande Cell Bank: Frysförvaring av Passage 2 dag 3-5 RPE Obs: frysa celler medan de är subconfluent (~ 50%) och har inte återfått pigment.
<ol><li>Baserat på antalet celler, beräkna volymen av frysförvaring medium med 10% DMSO behövs för att resuspendera cellerna vid en koncentration på 3 x 10 6 celler/mL.</li>
	<li>Följ steg 5.2 till 5,8. Omsuspendera cellpelleten frysförvaring medium med 10% DMSO till 3 x 10 6 celler/mL och överför 1 mL cellsuspension till 1,2 mL injektionsflaskor av kryogen.</li>
	<li>Placera kryogen injektionsflaskor i en frysning behållare avsedd att kyla vid-1 ° C/min och placera vid-80 ° C över natten. Överföra till flytande kväve för långsiktig lagring. 
	Obs: Dessa celler kommer att passagen 3 vid upptining. Odla cellerna för 30 dagar innan karakterisering. Utsäde passage 3 RPE 1,5 x 10 5 per cm 2 vid upptining. 2 , 4 , 6 , 7</li></ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Making+Stem+Cells+Retinal:+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+With+Ocular+Disease.">Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Based+Therapies+in+Combination+with+Substrate+for+the+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration.">Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).</li><li>Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium.">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li><li>Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Pigment+Epithelial+Cells:+Development+In+Vivo+and+Derivation+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+In+Vitro+for+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration.">Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).</li><li>Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical/&#946;-catenin+Wnt+pathway+activation+improves+retinal+pigmented+epithelium+derivation+from+human+embryonic+stem+cells.">Canonical/&#946;-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+xeno-free+derivation+of+retinal+pigmented+epithelial+cells+on+a+novel,+synthetic+substrate.">Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate.</a> Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).</li><li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium:+A+Comparative+Study+Between+Cell+Lines+and+Differentiation+Methods.">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li><li>Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Choudhary, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+Toward+Retinal+Pigment+Epithelium+Lineage.">Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage.</a> Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).</li><li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-directed,+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li><li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+efficient+retinal+pigment+epithelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+spontaneous+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).</li><li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li><li>Croze, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibition+Extends+Passage+of+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium.">ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).</li></ol>

Dr. Clegg är en av grundarna av regenerativ Patch Technologies LLC.

Det här protokollet beskriver hur man producerar retinal pigment epitelceller från pluripotenta stamceller. Metoden var optimerad använder både mänskliga embryonala och inducerade pluripotenta stamceller från en feeder-fri, serum-fri kultur-metod. Sedan den inledande isoleringen av mänskliga embryonala stamceller 1998 och härledningen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) 2007 utvecklat en mängd stamceller kultur metoder har varit14,15,16, 17. Dessa metoder bör vara tillräckligt för att producera stamceller kolonier som är mottagliga för denna differentiering. Det finns inga kända begränsningar tillämpligheten av denna metod för att korrekt härledda och underhållna pluripotenta stamceller.
De viktigaste stegen är den passaging av stamceller till dag 0 differentiering (steg 2.5) och potentiella behovet av manuell dissektion dag 14 av processen (steg 4,5). När du plockar bort differentierade celler från stamceller kolonierna, se bilderna i Kent18. Som indikerat, ange fibroblastic celler mellan kolonierna och ogenomskinlig cellerna inom kolonier differentierade celler som måste tas bort innan du börjar detta protokoll18. Bara odifferentierade, tätt packade kolonier med definierade kanter bör vara passaged för differentiering.
Antalet stamceller seedade per brunn (steg 2.6.7) kompliceras av det faktum att stamcellerna kan inte vara finfördelas till en enda cellsuspension på passagen och inte räknas noggrant med hjälp av en hemocytometer. Tillnärmning av 80% konfluenta stamceller är indicerat för passaging 1 väl av en 6-well platta i 4 brunnar 12-bra platta. Skillnader mellan stamcellslinjer, såsom tillväxt, kan påverka hur snabbt omogna RPE nå sammanflödet mellan dagar 0 till 4. Stamcellerna kommer att producera RPE oavsett exakt sammanflödet, men cellen avkastningen kommer att påverkas negativt om cellerna är alltför gles i detta skede. Omogna RPE-cellerna bör vara cirka 40-50% konfluenta på dag 1 och nästan 100% konfluenta dag 4. Om cellerna inte producerar en konfluenta enskiktslager av dag 4 eller 6, bör protokollet upprepas på en högre sådd densitet på dag 0. Till exempel om 1 väl av en 6-well platta var anpassade till 4 brunnar 12-well platta på dag 0 och omogna RPE är inte 100% konfluenta på dag 4, minska den sådd till en 1:3 eller 1:2 passage på dag 0 eller tillåta stamcellerna att bli mer konfluenta innan passaging. Det är viktigt att fastställa en konsekvent sådd täthet när jämföra flera cellinjer.
Det manuella dissektion steget dag 14 är bara nödvändigt när icke-RPE-celler finns i kultur (figur 2 c). Sedan tillägg av CHIR99021 till protokollet kräver många pluripotenta stamcellslinjer lite till ingen manuell dissektion. Vissa preparat har en högre incidens av neurala fläckar och det är viktigt att ta bort dessa celler. Om RPE inte är livskraftiga på passage 0 genom passage 3, är det möjligt att upprepa differentiering protokollet tar tillräcklig tid för att ta bort alla icke-RPE-celler. Detta händer inte ofta, men det nämns här för att notera att steget dissektion på dag 14 kan optimeras när det behövs.
Det finns en mängd RPE differentiering protokoll som varierar i kostnad samt kultur metoder, effektivitet, kvantifiering och funktionell bedömning, den senare som har granskats noggrant2. Vi föredrar den 14-dagars metoden beskrivs här på grund av dess effekt, anpassningsförmåga och tillämplighet på ett brett utbud av cell linjer4,7,8. Det frysförvaring steget i detta protokoll ger också en stor fördel i att skapa en mellanliggande cell bank för framtida användning, undvika parti-för-parti variabilitet i experiment. Start med endast 4 brunnar 12-well platta, är det möjligt att expandera till 6 brunnar på passage 0 och T75 kolvar på passage 1 och 2. Vid passagen 2 dag 3-5, när cellerna är fortfarande subconfluent och har inte återfått pigment, är det möjligt att frysa tiotals miljoner celler och sedan Tina mogen RPE, designerat passage 3 dag 30, att kontrollera RNA uttryck, proteinuttryck, tillväxtfaktor sekretion, fagocytos, etc. Vi har också etablerat protokoll för att expandera RPE för upp till 13 passager 19.
Ser fram emot, kommer att denna metod vara användbart för iPSC modellering av okulär sjukdom och för generering av RPE för cellterapi. När det gäller iPSC sjukdom modellering används detta protokoll i labbet för att producera RPE från CRISPR-korrigerade raderna med icke-korrigerade kontroller från samma patient. Detta protokoll är dessutom anpassas till syntetiskt substrat och xeno-fria villkor som är användbara för att följa god tillverkningssed krävs en cellulär terapi.

Retinal pigmentepitel är en enskiktslager av pigmenterade celler som ger avgörande stöd för fotoreceptorer. Retinal pigment epitelceller (RPE) har många funktioner i vision, inklusive ljusabsorption, näringsämne och ion transport, retinoid Cykling, ljusmätare yttre segmentet fagocytos, och tillväxtfaktor sekretion1. Det finns en mängd olika retinala dystrofier som påverkar funktionen av RPE och resulterar i en förlust av vision, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration och retinitis pigmentosa. Generation av RPE från pluripotenta stamceller kan underlätta forskning för att förstå dessa ögonsjukdomar, och kan ge en obegränsad källa av RPE för cell terapier2. I själva verket använder flera kliniska prövningar pågår RPE härrör från pluripotenta stamceller3.
Denna differentiering protokoll beskrevs ursprungligen av Buchholz4 och baserades på tidigare publicerade metoden från Clegg5. Förfarandet härmar normala i vivo utvecklings processen för direkt odifferentierade pluripotenta stamceller mot en RPE öde via manipulation av insulin tillväxtfaktorer (IGF), basic fibroblast tillväxtfaktor (FGF-2; FGF-basic), omvandla tillväxt factor-beta (TGF-β), och WNT vägar4,5. Protokollet var signifikant bättre genom tillsats av en WNT väg agonist sent i protokollet, vilket gav 97.77% ± 0,1% pre-melanosome protein (PMEL) positiva celler, och har anpassats till xeno-fria villkor6,7. Den resulterande RPE har visat att uttrycka RPE markörer på avskrift och protein nivåer att utsöndra kända RPE tillväxtfaktorer med rätt polaritet och utföra fagocytos av ljusmätare yttre segment8. Detta protokoll är mer snabb och pålitlig än ”spontana” protokoll om differentiering som innebär enkel borttagning av basic fibroblast tillväxtfaktor8. Dessutom RNA-sekvensering data visar att RPE erhållits med detta protokoll är mycket lika dem som erhållits med den vanliga spontana tillvägagångssätt8. 14-dagars metoden genererar RPE som passar ”5 PS” nämns av Mazzoni9 (pigmenterade, polariserade, fagocytos, efter mitotiska, polygona)9. Medan detta förfarande har visat sig vara reproducerbara i flera labs, vill vi uppmärksamma flera ytterligare riktad differentiering metoder som har publicerats i senaste åren10,11,12 , 13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td>model: SG603A-HE, type: A2, class: 2</td>
			<td>6&#39; Baker laminar flow biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Model 3970405</td>
			<td>laminar flow bench top</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ 1500</td>
			<td>heated stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-17AIC</td>
			<td>37 oC and 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse noggin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1967-NG-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human DKK-1</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>5439-DK-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant IGF-1</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>291-G1-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human/mouse/rat Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402 FGF inhibitor</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-204308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>growth factor reduced ECMH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Versene (EDTA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 10 (RPE supporting medium)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BW04-743Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>12-541-0 (1254)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>210102</td>
			<td>cryopreservation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 mL Cryogenic Vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty (freezing container)</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td>antimicrobial reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3516</td>
			<td>Used during differentiation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td>Used during RPE maturation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3513</td>
			<td>Used during RPE maturation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-771-1A</td>
			<td>Used during passages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Used during passages before cell count.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells

Vi beskriver en robust metod för direkt differentiering av pluripotenta stamceller till retinal pigment epitelceller (RPE). Syfte att tillhandahålla en detaljerad och noggrann protokoll är att tydligt visa varje steg och att göra tillgängliga för forskare i fältet. Detta protokoll resulterar i en homogen lager av RPE med minimal eller ingen manuell dissektion som behövs. Metoden presenteras här har visat sig vara effektivt för inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) och mänskliga embryonala stamceller. Dessutom beskriver vi metoder för Frysförvaring av mellanliggande cellbanker som gör långsiktig lagring. RPE genereras använder det här protokollet kan vara användbart för iPSC sjukdom-i-ett-skålen modellering eller klinisk tillämpning.

Denna metod resulterar i produktionen av en homogen, pigmenterad och kubiskt enskiktslager av RPE. Tidslinjen i figur 1 motsvarar bilderna skildras i figur 2. Som visas i figur 2A, är stamceller kolonierna tätt packat med definierade kanter och inga fibroblastic celler mellan kolonier eller ogenomskinlig celler inom kolonier. Figur 2B ger en representation av omogna RPE som är subconfluent. Om cellerna är redan konfluenta i detta skede, kan inte de utöka prognoser som är kritiska till differentiering processen. Celler som är kraftigt subconfluent kommer inte att kunna upprätta en enskiktslager och bildar tight junctions, karakteristiska av epitel. Detaljer om hur du optimerar denna sammanflödet beskrivs i diskussionsavsnittet. Figur 2 c visar morfologi av de två vanligaste typerna av icke-RPE som kan uppstå under denna differentiering process: neurala eller fibroblastic fläckar. Det är viktigt att notera att dessa neurala fläckar visas särskilt ogenomskinlig på dissekera Mikroskop, medan den definiera, fibroblastic-liknande fläckar är nästan genomskinlig på dissekera Mikroskop. Det kan vara bra att markera dessa områden på en vävnadskultur tallrik med en etanol-bevis lab-pennan för att lättare identifiera dem på både sammansatta ljusmikroskop och dissekera mikroskopet. Siffror 2D-F visar den karakteristiska ljusa kanter, kullersten morfologi och pigmentering som tyder på en frisk, förfaller kultur av RPE. Figur 3 är en högre förstoring bild att Visa fullt mogen RPE avbildad av faskontrast och ljusa fält mikroskopi olika utseende. Vid passagen är 3 dag 30, cellerna redo för karakterisering som har beskrivits i tidigare publikationer, inklusive RNA uttryck, proteinuttryck, tillväxtfaktor sekretion och fagocytos2,4,6 ,7. Dessa karakteriseringar visar att cellerna representerade i dessa bilder är inte bara pigmenterade och ton, men även fagocytos, efter mitotiska och polariserad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
Figur 1:. Tidslinje för tillägg av tillväxtfaktorer och mognaden av RPE. Tillväxtfaktorer läggs till 12 brunnar från dag 0-14. Mognar RPE odlas i 6-väl plattor eller T75 kolvar från dagen av berikning till 30 dagar efter upptining (passage 3 dag 30). Pilarna anger enzymatisk cell passaging. (A-E) nedanför tidslinjerna motsvarar bilderna i figur 2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
Figur 2: representativa morfologi och sammanflödet av förfallande RPE. Inducerade pluripotenta stamceller omedelbart före passaging för differentiering (A). Omogna subconfluent till RPE-celler på dag 2 (B) och innan plocka-att ta bort berikning på dag 14. icke-RPE fläckar (indikeras av vita pilarna) visas som fläckar eller ogenomskinlig ”band” (C). RPE vid passagen 0, 1 och 3 på dag 30 (D, E, och F). Skalstapeln = 200 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
Figur 3: mogen RPE vid passagen 3: dag 30 Kubiskt morfologi skildras i faskontrast (A) och pigmentering som skildras i ljusa-fältet (B). Skalstapeln = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Det här protokollet beskriver hur man producerar retinal pigment epitelceller (RPE) från pluripotenta stamceller. Metoden använder en kombination av tillväxtfaktorer och små molekyler för att styra differentieringen av stamceller in i omogna RPE i fjorton dagar och mogen, funktionella RPE efter tre månader.

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effektiv Derivering av näthinnans pigmentepitel celler från stamceller

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Härrör näthinnans pigmentepitel (RPE) från inducerade pluripotenta stamceller (iPS) Celler med olika storlekar av Embryoid organ

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Odla Primär Nasal epitelceller från barn och programmera in inducerade pluripotenta stamceller

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Snabb neuronal differentiering av inducerade pluripotenta stamceller för att mäta nätverksaktivitet på Micro-elektrod arrayer

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regisserad differentiering av primitiv och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller från mänskliga pluripotenta stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro-differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till trophoblastic celler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Differentierande kondrocyter från perifert blod härledda humana inducerade plöripotenta stamceller

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Engineering Transplantation-lämplig Retinal Pigment epitel vävnad härrör från mänskliga embryonala stamceller

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effektiv och skalbar riktad differentiering av kliniskt kompatibel korneal limbala epitelial stamceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...