Name: microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי משרד החקלאות-NIFA פרס 2015-67015-23488 רוג'ר חרוט. המחברים מודים ד ר רונלד פלפס על התיאור של קריטריוני הבחירה מניות שבוחרים וידאו. אחמד Elaswad, כרים חליל רוצה להודות את התרבות המצרית, הלשכה חינוכיים בוושינגטון למימון המחקר Ph.d. שלהם.

ניסוי זה נערך היחידה לחקר הגנטיקה של דגים, אי מעטפת וו הדיג מרכז מחקר, אוניברסיטת אובורן, AL. כל הפרוטוקולים ניסיוני השתמשו בניסוי זה אושרו על ידי אובורן אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (AU-IACUC) לפני הניסוי היה יזם. רשימה של ציוד ואספקה השתמשו בניסוי זה ניתן למצוא בטבלת חומרים. להל...

הוצג פרוטוקול מפורט עבור microinjection של ערוץ שפמנון העוברים על מנת להשיג נוקאאוט גנטי. הזרקה של חלבון CRISPR/Cas9 החלמון היא הרבה יותר פשוטה, חוסך זמן, אינה דורשת הכשרה נרחבת בהשוואה microinjecting של blastodisc של העובר תא אחד, אשר הוא הטכניקה נפוצה ברוב העברה גנטית ועריכה ג'ין עם דגים 30 , <sup c...

Microinjection היא טכניקה מעבדה נפוץ נהגה לספק כמות קטנה של חומר כמו DNA, RNA, חלבון ו מקרומולקולות אחרות לתוך תאים או עוברי דרך נימי זכוכית1. Microinjection מתבצעת באמצעות ציוד מיוחד ההתקנה כולל של microinjector, micromanipulator ו- מיקרוסקופ2. הטכניקה נעשה שימוש על ידי חוקרים כדי שינוי גנטי אורגניזמים רבים דרך הדור של transgenics, ג'ין הסתרה ולאחר טיפול גנטי, במטרה להבין את הדינמיקה של רכיבים תאיים3,4 , 5.
השפמנון ערוץ (Ictalurus punctatus) הוא המין שפמנון הפופולרי ביותר בחקלאות מים ופעילויות פנאי דיג בארצות הברית. יש צורך להגדיל ללמוד גנומיקה תפקודית ב ערוץ שפמנון ומגביר את רצף הגנום המלא של ערוץ שפמנון השירות של התפתחויות אחרונות הגנום-6,כלים-עריכה-7. להבנת תפקוד הגן לא רק להעשיר את המחקר מתנהל על שפמנון, אך גם להוביל תוכניות שיפור גנטי יעיל יותר כדי לשפר את תעשיית שפמנון. ברגע גנים קריטי עבור תכונה נתונה עניין מזוהים, הם יכולים לשמש לשיפור גנטית שפמנון ייצור באמצעות הגנום עריכה כדי להפיק תועלת אללים, הבחירה עבור אלה אללים, דיכוי של אללים מזיקה, העברת אללים מועיל דרך transgenesis, או שילוב של אפשרויות אלה. שילוב של הגנים הטובים ביותר עבור תכונות מועילות מסחרית שונים מ מינים שונים של דגים אחד לשפר במידה רבה פריון ורווחיות של דגים הפקה פעילות8.
נוקאאוט גנטי היא שיטה ישירה ללמוד ג'ין פונקציות בתוך vivo. מוטציות סמני דנ א תעבור בירושה לדורות אשר יקל את חקר ההשפעות שלהם בדורות שונים. כלי עריכה הגנום שונים יש כבר מפותחת כולל אבץ אצבע nucleases (ZFNs), תמלול אפקטור activator דמוי nucleases (TALENs), מקובצים באופן קבוע interspaced קצר palindromic חזרה/CRISPR-הקשורים חלבון 9 (CRISPR/Cas9 ) מערכת9,10,11,12.
מערכת CRISPR/Cas9 הוא כלי רב עוצמה, יעיל ששימש לעריכת רצפי דנ א גנומי כולל נוקאאוט גנטי בדגים עד מונחה RNA ספציפי לאתר ה-DNA המחשוף5,13. המערכת מורכבת RNA מדריך (gRNA), אשר קובע את רצף יישוב הגנום, אנזים endonuclease דנ א, Cas9. ניתן לעצב את מערכת CRISPR/Cas9 היעד כל רצף הגנום עם מספר יתרונות על ZFNs ועל TALENs: נמוך (1) עלות (2) קל הנדסה קשירה (3) יותר ספציפי של מדריך RNA רצף המטרה, צמצמה את המטרה מוטציות (4) ניתן לפלח רצפים מרובים עם gRNA שונים באותו זמן (5) מוטגנזה מכוונת גבוה קצב גנים יכול לא להיות מוטציה על ידי TALENs, (6) קצב השידור germline משופרת של מוטציות עבור עד 6-fold בהשוואה ZFNs, TALENs14, 15,16,17,18.
שיטת אלטרנטיבית הראשי עבור microinjection היא אלקטרופורציה, שבו מוחלות דחפים חשמליים העוברים או לתאים להגברת חדירות הממברנה ואת ספיגת של מולקולות ביולוגיות19,20. מספר דגים הטרנסגניים נוצרו באמצעות אלקטרופורציה כגון ערוץ שפמנון, שישן (Sparus sarba), סלמון צ'ינוק (Oncorhynchus tshawytscha), דג זברה (רזבורה rerio), medaka (Oryzias latipes), נפוץ קרפיון (קרפיון carpio)21,22,23,24,25,26.
אלקטרופורציה שימש כדי לספק חלבון ה-DNA, RNA ו- Cas9 פלסמיד עבור נוקאאוט גנטי. בתרבית של תאים, Cas9/gRNA פלסמיד ה-DNA, Cas9 mRNA/gRNA, Cas9 חלבון/gRNA מתחמי נשלחו באמצעות אלקטרופורציה, תעריפי מוטגנזה מכוונת הגבוהה ביותר באמצעות קומפלקסים של חלבונים/gRNA Cas9 עבור אלקטרופורציה רוב התנאים נבדקו27. Ascidian מיתרניים (Ciona intestinalis), היו TALENs המבטאת מבנים electroporated לתוך הביצים לזירוז נוקאאוט של גנים מרובים28. ZFNs לבטא פלסמיד בונה היו electroporated לדפוק את הורמון מחלמן שפמנון ערוץ29. עם זאת, ברגע הציג לתוך התא, בונה פלסמיד יהיה עליך להיות עיבד את ה-RNA, תרגם חלבונים פונקציונליים לפני בהם ניתן לסמן את רצף ה-DNA הרצוי, אשר סביר להניח יעכב את הזמן של מוטגנזה מכוונת לעומת microinjection של RNA / חלבון. כאשר העובר מתפתח, מוטגנזה מכוונת מושהית מגביר את פסיפס של מייסדי מוזרק. בנוסף, ביטוי הטרנסגניים סביר להשגת רמת ביטוי אפשרי עם microinjection, מוריד את היעילות מוטגנזה מכוונת.
כאמצעי ידביקו כלי עריכה הגנום בתאים, microinjection יש כמה יתרונות על פני אלקטרופורציה. הגנום עריכה מולקולות שיוכל אמינה להיכנס לתוך התאים או עוברי דרך microinjection30. חומר ההזרקה פחות נחוץ. . זה קל לקבוע את הכמויות של חומר מוזרק... מוטציה גבוהה המחירים עם פסיפס נמוך ב הדג מייסד יכולה להיות מושגת אשר תשפר germline שידור של מוטציות F1. דגים מייסד פחות צריך להיות מנותח כדי לייצר את הדור הראשון, עקב קצב מוטציה גבוהה יותר. אלקטרופורציה, עוד דגים מייסד צריך להיות מנותח אשר יגדיל עלויות. עם זאת, ההישרדות של ערוץ שפמנון microinjected עוברי הוא נמוך יותר electroporated אלה, אבל זה ניתן להתגבר על ידי הזרקת העוברים עוד31,32. ערוץ שפמנון, ההישרדות של microinjected-חלמון עוברי נע בין 16 ל- 55%, בהתאם הגנים מהווים מטרה, את המינון של חלבון gRNA/Cas932.
Microinjection קבוע של שפמנון העוברים הוא תובעני מבחינה טכנית, זמן רב, עם זאת, פרוטוקול microinjection חלבון CRISPR/Cas9 מהיר ויעיל מוצג עבור ערוץ שפמנון עוברי. פרוטוקול זה דורש פחות זמן ומומחיות מאז הפתרון חלבון CRISPR/Cas9 מוזרק לתוך החלמון של עוברי לתא אחד. יכול להיות מוזרק מאות הביצים ב h 1 (כ הזמן הדרוש עבור ליגה תא להתרחש). כדי לאמת את הפרוטוקול, שני גנים למחלות הקשורות הרגישות קיבלת מכה שפמנון ערוץ, את האגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן, הגן לקטין (RBL) מחייב rhamnose. 1 טיקם מעורב מסלול איתות שיזם קולטן דמוי-אגרה (TLR) 3. ערוץ שפמנון, טיקם 1 היה דרמטי upregulated בעקבות האתגר חיידקי עם Edwardsiella ictaluri, עוד הייתה downregulated ב כחול שפמנון, עמיד ictaluri ה33מינים. RBL ממלא תפקיד חשוב ב זיהום מוקדם עם Flavobacterium columnare, סוכן סיבתי של מחלת columnaris, שבו חריפה, קולטנים upregulation חזקים נרשמה זן שפמנון ערוץ columnaris, רגישים בהשוואה זן עמיד columnaris34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:136px;">Reproboost implant</td>
			<td style="width:115px;">Center of Marine Biotechnology</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">TRICAINE-S</td>
			<td style="width:115px;">Western Chemical. Inc.</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:136px;">Phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">P0290</td>
			<td style="width:171px;">0.5%, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;">213709</td>
			<td style="width:171px;">For visualizing the eggs during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Microinjector</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MPPI-3</td>
			<td style="width:171px;">For the delivery of the injection material into the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MM33&#160;</td>
			<td style="width:171px;">For holding and controlling the movement of the injection needle.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Eppendorf Microloader</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">5242956.003</td>
			<td style="width:171px;">For loading injection solution into microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:136px;">Vertical needle puller</td>
			<td style="width:115px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:99px;">Model 720</td>
			<td style="width:171px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Cas9 protein</td>
			<td style="width:115px;">PNA Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:99px;">CP01</td>
			<td style="width:171px;">Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Expand High FidelityPLUS PCR System</td>
			<td style="width:115px;">&#160;Roche Diagnostics, USA</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">25384-302</td>
			<td style="width:171px;">For holding the embryos during the microinjection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Crisco</td>
			<td style="width:115px;">The J.M. Smucker Company</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:136px;">Holtfreter`s solution</td>
			<td style="width:115px;">Home Made</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Doxycycline hyclate USP (monohydrate)</td>
			<td style="width:115px;">Letco Medical</td>
			<td style="width:99px;">690904</td>
			<td style="width:171px;">Antibiotic added to Holtfreter&#39;s solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing

הגנום המלא של השפמנון ערוץ, Ictalurus punctatus, יש כבר וסודרו, שמוביל הזדמנויות ללמוד ערוץ שפמנון ג'ין פונקציה. נוקאאוט גנטי שימש ללמוד פונקציות אלה ג'ין בתוך vivo. באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) המערכת היא כלי רב עוצמה המשמש לעריכת רצפי דנ א גנומי לשנות תפקוד הגן. בזמן הגישה המסורתית הייתה להציג CRISPR/Cas9 mRNA לתוך תא בודד העוברים דרך microinjection, זה יכול להיות תהליך איטי ולא יעיל של שפמנון. . הנה, מתואר פרוטוקול מפורט עבור microinjection של העוברים ערוץ שפמנון. עם חלבון CRISPR/Cas9. בקצרה, ביצים, הזרע היו הפריה שנאספו, ואז מלאכותיים שבוצעה. הביצים הועברו צלחת פטרי המכילות הפתרון של Holtfreter. נפח הזרקה היה מכויל, ואז מדריך RNAs/Cas9 מיקוד אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (טיקם 1) הגן לקולטן וג'ין לקטין (RBL) rhamnose האיגוד היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. נוקאאוט גנטי היה מוצלח כמו indels שאושרו על-ידי רצפי DNA. התיקונים רצף החלבון החזוי עקב מוטציות אלה כלולים frameshift, נחתך החלבון עקב עצירה מוקדמת codons.

כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול microinjection, gRNAs שנועדו למקד את השפמנון ערוץ אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן וג'ין rhamnose איגוד לקטין (RBL) היו microinjected.
טיקם 1 רצפי DNA של וקטורים של מושבות בודדות ממוצרי?...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing at JoVE.com

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג'ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...